合成生物学系列之 Trimer引物合成与DNA文库合成

前言

遗传密码（又称三联体密码子）是信使RNA（mRNA）中三个连续的核苷酸序列，代表某一种氨基酸的规律，可用于蛋白质合成。现有理论分析四种碱基的组合有43种，即64种密码子，覆盖了20种氨基酸组合，决定了蛋白质的生成，从而影响生物学功能。

科研工作者通常期望通过蛋白质的诱变来改善生物学功能，如增强表达水平、稳定性、溶解性、酶活性或结合亲和力等。为了探索蛋白质的生物学功能，重要蛋白质区域的序列及空间结构会被挑选、进行研究，但由于密码子存在偏向性及终止密码子参入等问题，研究进展受到阻碍。

研究进展

为了解决上述问题，科学家们最先是通过一些饱和诱变方法对蛋白质空间的整个中心区域进行简并诱变，如广泛使用NNN和NNK的方法产生蛋白质混合物。但此法并不能完全消除终止密码子和密码子偏差等问题，甚至会引入终止密码子和高比例的特定氨基酸，导致筛选时间和成本的增加。此外，利用普通简并寡核苷酸创建的蛋白质文库也会高度偏向那些冗余密码子。为了避免这个问题，Hughes等人研究出一种新的诱变方法，即对常规寡核苷酸混合物进行杂交筛选以去除密码子冗余、终止密码子和完全随机化的寡核苷酸模板。这个过程看似简单，但由于密码子存在简并性，密码子突变频率仍具有很大的偏向性。后来，Krumpe等人研究发现了高度有效的寡核苷酸定向诱变方法（图1），即利用2'-脱氧核苷三聚体亚磷酰胺修饰，最终解决了密码子冗余和终止密码子等问题。

图1：三聚体亚磷酰胺（DMTr基团保护）的合成途径

泓迅科技Trimer 引物

泓迅科技采用一种新的基于密码子水平的Trimer 引物合成技术来合成突变引物，可以去除饱和诱变方法导致的密码子冗余和终止密码子的简并寡核苷酸。我们能够根据客户的实际需求提供多种氨基酸定制服务（图2）。

图2：三聚体密码子（可定制密码子）

泓迅案例

泓迅科技针对Trimer引物提供高度定制化服务。按照特定需求，每个位点的氨基酸变化数和比例偏差都要不相同（图3）。我们设计并合成的Trimer引物实际标准方差符合最终要求，引物质量高，获得客户认可（图4）。

以如下引物为例，X代表要求的密码子突变位置。ACCG*************TGCCX1X2X3X4X5X6TGTX7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17TACX18TACT*************ACTT。

其中，X1 Trimer=A（80%）：G（3%）：R（3%）：S（3%）：T（8%）：V（3%）。

图3.客户需求与实际合成氨基酸的比例（部分）

图4.泓迅科技Trimer引物实际标准方差

泓迅科技DNA文库

泓迅科技可利用Trimer突变引物，合成带有特定氨基酸碱基的引物。通过PCR拼接此类引物构建DNA文库，克隆到载体。随机检测克隆，测序不同长度的基因，NGS验证文库正确率为60%-95%。我们构建的定点饱和突变文库（图5），可确保任一位点都包含20种氨基酸，符合客户需求，可用来验证蛋白质结构与功能之间的关系。

图5：定点饱和突变文库示意图

此外，除了定点饱和突变文库，泓迅科技还提供以下DNA文库。

丙氨酸扫描文库

通过用丙氨酸逐一取代每一个位置或关键位置的氨基酸，发现对蛋白功能、相互作用和形态具有重要作用的氨基酸残基。

简并突变文库

构建简并碱基突变文库对蛋白某一位点或某几位点、甚至某些功能区域进行结构和功能分析。

氨基酸随机突变文库

泓迅科技利用自主开发的Syno®Random PCR Platform，可实现可控、高精度的随机化突变合成。随机突变频率可以精确控制在1-4个突变/kb，4-8个突变/kb和8-12个突变/kb中任意一种形式。

抗体文库

合成多样性高的抗体文库，提高抗体特异性、免疫原性、亲和性等。

模块替换文库

拼接多种DNA元件（包括调控区或编码区）构建各种遗传模块/区域或通路。

参考文献：

[1] Gaytán P, ContreraszambranoC, OrtizalvaradoM, et al. TrimerDimer: an oligonucleotide-based saturation mutagenesis approachthat removes redundant and stop codons[J]. Nucleic Acids Research, 2009,37(18):e125-e125.

[2] Krumpe L R, Schumacher K M, Mcmahon J B, et al.Trinucleotide cassettes increase diversity of T7 phage-displayed peptidelibrary[J]. Bmc Biotechnology, 2007, 7(1):65-65.