1.    实验目的

使用抗原免疫后羊驼PBMC构建的噬菌体文库筛选能特异性结合抗原的纳米抗体序列。

2.    实验设计

通过将抗原包被至免疫管，使用构建的噬菌体展示文库对特异性结合的噬菌体进行多轮淘洗筛选，当淘洗后的噬菌体达到合适富集程度后进行ELISA验证以排除非特异性序列，最后对ELISA验证阳性克隆进行测序获得相应纳米抗体的序列。

 

3.    实验方法与步骤

3.1第一轮筛选

3.1.1从-80℃冰箱中取出筛选抗原，冰上放置解冻；

3.1.2将XX抗原包被免疫管（50µg/管，包被液为CBS，pH9.6，2ml /管），4°C缓慢旋转过夜，同时平行包被50µg 5% Non-fat milk脱脂奶粉作对照；

3.1.3将过夜包被的免疫管中的液体弃掉，加入2ml PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；

3.1.4加入2ml封闭液（3% PBSTB）溶液，室温旋转封闭2h；

3.1.5将封闭后的免疫管中液体丢弃，并加入1ml PBS缓冲液室温清洗免疫管3次，每次旋转5min；

3.1.6弃掉免疫管中的清洗液，加入2ml PBS缓冲液，按照下列公式计算并加入制备的噬菌体文库作为第一轮筛选输入噬菌体文库，室温旋转孵育1h：

3.1.7将免疫管内液体弃掉，加入2ml PBST（1×PBS加0.1% Tween20，下同）缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5min；

3.1.8将免疫管内液体弃掉，尽量去除残余液体，加入1ml 0.25mg/ml Trypsin溶液，室温旋转洗脱30min；

3.1.9加入10μl 10%AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5ml离心管中，即为第一轮筛选噬菌体洗脱液。

3.2第一轮噬菌体洗脱液效价检测

3.2.1将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基（Tet抗性）进行单菌落划线，37℃过夜培养（4℃保存一周），从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养；

3.2.2取过夜培养菌液250μl转接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600为0.5-0.55；

3.2.3取第一轮噬菌体洗脱液10μl，在1.5ml离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，即将噬菌体文库取10μl稀释至100μl，再从中取10μl稀释至100μl，依次类推，共稀释12个梯度至10-12，振荡混匀；

3.2.4在每个稀释离心管中加入90μl的SS320菌液，混匀后37℃孵育30min；

3.2.5从每个稀释离心管中取5μl滴加到2×YT固体培养基（Amp）中，37℃倒置过夜培养；

3.2.6统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量，并按照下面公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价。

3.3第一轮噬菌体洗脱液的扩增

3.3.1预先将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基（Tet抗性）进行单菌落划线，37℃过夜培养（4℃保存一周），从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养；

3.3.2取过夜培养菌液250μl转接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55；

3.3.3加入500μl第一轮筛选后得到的噬菌体洗脱液至OD600为0.5-0.55的菌液中（剩余的洗脱液4℃保存）；

3.3.3 37℃，220rpm继续培养30 min；

3.3.5将全部菌液均匀涂布到含有100μg/ml Amp和2%葡萄糖的2%琼脂糖的245mm方形培养基平板中，37℃过夜培养；

3.3.6取过夜培养的方形板，在培养板表面加入6ml 2×YT液体培养基（含10μg/ml Tet），用涂布棒轻轻将方形板菌落刮下并将菌液收集至15ml离心管中，即为扩增后的细菌子文库，同时使用分光光度计测量菌液OD600值，即为洗脱液细菌文库OD600值，加入终浓度为20%的甘油，即为第一轮细菌文库。

3.3.7将洗脱液细菌文库根据下面公式计算出相应菌液量，转接至100ml 2×YT液体培养基中（含10μg/ml Tet和100μg/ml Amp），以使初始OD600为0.1：

3.3.8 37℃，250rpm培养直至菌液OD600达到0.5-0.55；

3.3.9加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数：噬菌体数=1：20；

3.3.10 37℃，220rpm继续培养30 min；

3.2.11分别加入终浓度为50μg/mlKana和终浓度为0.2μM IPTG，30℃，250rpm过夜培养。

3.4第一轮噬菌体纯化

3.4.1将过夜培养的菌液转移至新的50ml离心管中4000 rpm，4 ℃离心10min；

3.4.2将离心后的上清液转移至新的50ml离心管中，加入1/4体积的4℃预冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混匀后冰上放置30min；

3.4.3 4000 rpm，4 ℃离心20 min，弃上清，并在纸上倒置2min；

3.4.4加入1ml PBS重悬沉淀，将重悬液移至新的1.5ml离心管，12000rpm，4 ℃离心20min；

3.4.5将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管，加入1/4体积预冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混匀后冰上放置10min；

3.4.6 12000rpm，4 ℃离心10min，弃上清，加入1ml PBS重悬沉淀；

3.4.7 12000rpm，4 ℃离心2min，将上清转移到新的1.5ml离心管中，即为第一轮筛选噬菌体子文库，100μl /管分装，长期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存

3.4.8第一轮筛选噬菌体子文库效价检测，方法同3.2。

3.5第二轮筛选

筛选方法同3.1，输入噬菌体为第一轮筛选得到噬菌体子文库，作为第二轮筛选输入噬菌体文库，得到第二轮筛选噬菌体洗脱液。

3.6第二轮噬菌体洗脱液效价检测

方法同3.2。

3.7第二轮洗脱液的扩增、纯化

方法同3.3-3.4，得到第二轮筛选噬菌体子文库。

3.8第二轮筛选噬菌体子文库效价检测，

方法同3.2。

3.9单克隆ELISA检测

3.9.1预先将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基（Tet抗性）进行单菌落划线，37℃过夜培养（4℃保存一周），从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养；

3.9.2取过夜培养菌液250μl转接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600值为0.5-0.55；

3.9.3取第二轮筛选后噬菌体洗脱液10μl，在1.5ml离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，即将噬菌体文库取10μl稀释至100μl，再从中取10μl稀释至100μl，依次类推，共稀释12个梯度至10-12，振荡混匀；

3.9.4每个稀释离心管中加入90μl OD600值为0.5-0.55的菌液，混合均匀；

3.9.5 37℃，220rpm继续培养30 min；

3.9.6将菌液均匀涂布到含有100μg/ml Amp的固体培养基平板，37℃过夜培养；

3.9.7从过夜培养后的培养基平板中随机挑取单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板中，每孔加入200µl 2×YT培养基（含有100µg/ml Amp和10µg/ml Tet），37℃过夜静置培养；

3.9.8取过夜培养的菌液2µl转接至每孔200µl 2×YT液体培养基（含有100µg/ml Amp和10µg/ml Tet）的新96孔细胞培养板中，37℃静置培养3h，将转接前过夜培养的菌液4℃保存；

3.9.9按照下面公式计算并每孔加入辅助噬菌体M13K07以使细菌个数：噬菌体数=1：20：

3.9.1037℃孵育30 min，加入终浓度为50µg/ml的Kana和0.2µM的IPTG，30℃静置过夜培养；

3.9.11将过夜培养后的96孔培养板4℃，4000rpm离心10min，4℃保存备用；

3.9.12将抗原包被酶标板（1ng/μl，包被液为CBS，pH9.6，100μl /孔），同时平行包被BSA作对照，4°C包被过夜；

3.9.13将过夜包被的酶标板内液体弃掉，每孔加入200µl PBS缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min；

3.9.14每孔加入200μl封闭液（3% BSA）封闭酶标板，室温封闭1h；

6.9.15弃封闭液，每孔加入200µL PBST（1×PBS加0.1% Tween20，下同）缓冲液，室温清洗酶标板3次，每次10min；

3.9.16每孔加入120μl 3% BSA后再加入80µl步骤3.6.11中离心后的上清液，室温孵育2h；

3.9.17弃掉酶标板内液体，每孔加入200µlPBST缓冲液洗涤3次，每次10min；

3.9.18每孔加入M13 Bacteriophage Antibody（HRP），Mouse Mab，稀释于封闭液中，100μl/孔，室温孵育1h；

3.9.19弃掉ELISA板内液体，每孔加入200µlPBST缓冲液洗涤3次，每次10min；

3.9.20每孔加入100µl TMB单组份显色液，避光显色2-3min，每孔加入100µl 1M HCl终止，用酶标仪读取OD450值，记录并保存。

3.10阳性克隆ELISA二次验证

为了排除假阳性结果，将初步认定为阳性克隆进行ELISA二次验证，方法同3.9.8-3.9.20。

3.11阳性克隆测序

根据ELISA检测数据和二次验证数据选定阳性单克隆

从单克隆ELISA检测（3.6.3）板中取阳性克隆菌液5µl接种至2ml 2×YT培养基（含有100µg/ml Amp和10µg/ml Tet），37℃，250 rpm培养直至OD600至0.8-1.0（约6-8h），取1ml菌液测序，其余菌液4℃保存。

3.12序列分析

经测序的序列使用软件进行序列比对分析，并使用软件将抗体序列翻译成氨基酸。

4.    实验结果

4.1二轮筛选结果

富集程度为筛选效价除于输入效价，数值越高表明抗体在输入库中富集程度越高；

相差倍数为筛选效价除于对照效价，数值越高表明阳性抗体在筛选库中含量越高。

当相差倍数大于100-1000倍时认为筛选进行ELISA单克隆检测。

4.2单克隆ELISA检测结果

免疫管筛选后，随机挑选单克隆进行ELISA检测，阳性克隆为目的抗原的OD450值大于对照OD450值3倍且读值大于0.5。

4.3阳性克隆ELISA二次验证结果

阳性克隆为目的抗原的OD450值大于对照OD450值3倍且读值大于0.5。

4.4序列多样性结果

将ELISA二次验证的阳性克隆进行测序，序列使用GENtle软件翻译得到抗体序列，通过序列比对分析，得到不同的抗体序列。

4.5氨基酸序列

将抗体序列使用GENtle软件翻译成氨基酸后，得到抗体序列。