羊驼免疫

1.     抗原混合

1.1     将抗原从-80℃冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融。做好标记。

1.2抽取抗原：根据抗原浓度抽取800μg，添加无菌超纯水至体积1000μl，混匀，加入同体积弗氏佐剂1000μl，共2ml混合进行乳化。

2.     羊驼免疫和采血

2.1羊驼选择：选择健康强壮、精神状态良好、体型适中的羊驼，挑选的羊驼毛色光亮，无受伤不适症状。挑选好动物，先预养1周左右以淘汰有些不合格的动物，使后期的实验能顺利进行。

2.2免疫：挑选好羊驼并确保动物适合，记录耳号后开始免疫实验。每次在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射，每侧分2点注射，每点注射1ml乳化抗原。免疫后观察30min确认羊驼状态良好，无不适症状，每2周免疫一次。

2.3采血和血清分离：在每次免疫前进行采血用于免疫评价，采血从羊驼颈部静脉采取，每次取5ml血液，3000rpm离心10min，分离保存上层血清。

3.     分离外周血单个核细胞（PBMC）

3.1 将离心机预温至25℃，使用前关闭刹车；

3.2 在50ml离心管中分别加入15mlPBS和15ml新鲜血液进行稀释，翻转数次混匀；

3.3加15ml分离液于新50ml离心管中，向分离液管中加入稀释好的血液，小心缓慢以防止血液和分离液混匀；

3.4500 g离心30min，观察离心管中血液分离情况，用200μl移液器小心吸取出中间棉层免疫细胞至新的15ml离心管中，上层血清保存在新的离心管中，-80℃保存；

3.5 向单核细胞液中加入3倍体积PBS缓冲液混匀，400g离心15min；

3.6 去除上清液，每管加入3mlPBS缓冲液混匀并进行细胞计数，400g离心20min；

3.7去除上清液，根据细胞数目使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞108/mL溶解液，-80℃保存。