1.    实验目的

使用抗原免疫后羊驼PBMC构建噬菌体文库

2.    实验设计

从羊驼PBMC中提取总RNA，反转录为cDNA，经过两轮PCR扩增后得到抗体序列扩增产物，选择载体进行酶切后连接，最后转化至SS320大肠杆菌感受态细胞得到细菌文库，经过辅助噬箘体（M13KO7）侵染并诱导后制备获得噬菌体文库。

3.    实验方法与步骤

3.1总RNA提取

3.1.1将羊驼PBMC样品从-80℃冰箱中取出，分装0.5ml/管，每管中加入100μl氯仿，在震荡器上剧烈震荡15s后，室温放置静置5min；

3.1.2将离心机预冷至4℃，12000g离心15min，离心后出现分层，将最上层的透明层用移液枪小心转移到新的无RNase和DNase的1.5ml离心管中，每管加入250μl的异丙醇，上下颠倒多次混匀后室温放置静置10min；

3.1.3 12000g离心10min，去除上清保留沉淀；

3.1.4每管加入1ml 75%乙醇，上下颠倒多次以悬浮沉淀；

3.1.57500g离心5min，去除上清保留沉淀；

3.1.6保持离心管口打开，室温放置干燥10min，每管加入DEPC处理水溶解，55℃孵育10min以确保RNA完全溶解；

3.1.7小心吸取至同一个离心管中，即为PBMC中提取出的总RNA；

3.1.8取1μl上述总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳以检测总RNA的完整性，同时取2μl用核酸浓度测量仪检测RNA的浓度和A260/A280并记录。

3.2 RNA反转录

样品在总RNA提取后立即使用反转录试剂盒进行反转录以减少RNA的降解。

3.2.1将上述总RNA样品分为两份，一份使用试剂盒内的Oligo dT Primer作为引物，另一份用试剂盒内的Random 6-mers作为引物，在1.5ml离心管中按下表比例配置反应液，当总RNA量大于5μg时，同比例扩大反应体系。

试剂	使用量
Oligo dT Primer（50μM）或者 Random 6-mers（50μM）	1μl
dNTP Mix	1μl
总RNA	5μg
ddH2O	Up to 10μl

3.2.2将含有上述反应液的离心管放入金属加热器中，65℃反应5min使RNA变性，反应结束后置于冰上迅速冷却；

3.2.3在上述1.5ml离心管中按下表比例配置反应液，当管内总体积大于10μl时，同比例扩大反应体系。

试剂	使用量
反应液	10μl
5×PrimeScript II Buffer	4μl
RNase Inhibitor	0.5μl
PrimeScript II RTase	1μl
ddH2O	Up to 20μl

3.2.4缓慢混匀后，将含有上述反应液的离心管放入金属加热器中，45℃反应60min，再75℃反应15min，冰上冷却，即为总RNA反转录后的cDNA，-20℃保存。

3.3 PCR扩增

3.3.1第一轮PCR

6.3.1.1以cDNA为模板进行第一轮PCR反应，为了确定最佳模板使用量，分别使用0.5μl，1μl，2μl，3μl，4μl，5μl的oligo dT Primer和random 6-mer的cDNA作为模板，按照下表配置PCR反应体系：

试剂	使用量
cDNA	0.5-5μl
AlpVh-L/CALL 002	2μl/2μl
dNTP Mix	4μl
10×ExTaq Buffer	5μl
HS Ex Taq	0.25μl
ddH2O	Up to 50μl

按照下表配置并进行PCR反应：

循环	温度	时间
步骤1	98℃	3min
步骤2	94℃	50s
	55℃	30s
	72℃	40s+2s/cycle
	转到步骤2	23 cycles
步骤3	72℃	5min
步骤4	4℃	forever

3.3.1.2反应结束后，取20μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将所有cDNA按照此模板量并使用3.3.1.1相同条件进行PCR反应；

3.3.1.3将所有PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的片段大小在600bp左右的条带；

3.3.1.4使用通用型DNA纯化回收试剂盒对切胶的胶条进行DNA回收，根据试剂盒说明书，按照下述步骤进行：

（1）柱平衡：向放入收集管中的吸附柱CB2中加入500μl平衡液BL，12000 rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（2）将从琼脂糖凝胶中切下的DNA条带放入干净的离心管中，称取重量；

（3）向胶块中加入等体积PC溶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，则加入100μlPC溶液），50℃水浴放置10 min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

（4）将上一步所得溶液加入平衡过的放入收集管中的吸附柱CB2中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

（5）向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

（6）重复操作步骤（5）；

（7）将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置2min，彻底晾干；

（8）将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl的ddH2O，室温放置2min。12000 rpm离心2 min，收集DNA溶液；

（9）      将所有纯化回收产物收集至一个离心管中，即为第一轮PCR扩增产物，-20℃保存。

3.3.2第二轮PCR

3.3.2.1将第一轮PCR扩增产物作为模板进行第二轮PCR反应，为了确定最佳模板使用量，分别使用0.1μl，0.2μl，0.3μl，0.5μl，1.0μl，2.0μl作为模板，按照下表配置PCR反应体系：

试剂	使用量
第一轮PCR回收产物	0.1-2μl
Rvhh FP/RvhhRP	2μl/2μl
dNTP Mix	4μl
10×ExTaq Buffer	5μl
HS Ex Taq	0.25μl
ddH2O	Up to 50μl

按照下表配置并进行PCR反应：

循环	温度	时间
步骤1	98℃	3min
步骤2	94℃	50s
	55℃	30s
	72℃	40s
	转到步骤2	11cycles
步骤3	72℃	5min
步骤4	4℃	forever

3.3.2.2反应结束后，取20μl PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，最终选取电泳结果中目的条带单一且片段大小为600bp的模板量为最佳模板量，将已获得的第一轮PCR扩增产物的1/20体积共576个反应按照此模板量并使用3.3.2.1相同条件进行PCR反应；

3.3.2.3使用通用型DNA纯化回收试剂盒对PCR反应液进行DNA纯化，根据试剂盒说明书，按照下述步骤进行：

（1）柱平衡：向放入收集管中的吸附柱CB2中加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

（2）根据PCR反应液的体积，向其中加入等倍体积PC溶液，充分混匀；

（3）将上一步所得溶液加入一个放入收集管中的吸附柱CB2中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

（4）向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW（使用前请先确认已加入无水乙醇），12000rpm离心1分min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；

（5）重复操作步骤（4）；

（6）将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置2min，彻底晾干；

（7）将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl的ddH2O，室温放置2min，12000 rpm离心2 min，收集DNA溶液。

（8）将回收回的所有产到物收集至一个离心管中，即为第二轮PCR扩增产物，同时取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，其余产物-20℃保存。

3.4载体与PCR产物酶切连接

3.4.1酶切体系分别如下表。

载体酶切体系：

试剂	用量
载体	10μg
Bgl 1	10μl
3.1 10×Buffer	50μl
ddH2O	Up to 500μl

第二轮PCR扩增产物酶切体系：

试剂	用量
第二轮PCR扩增产物	4μg
Bgl 1	4μl
3.1 10×Buffer	20μl
ddH2O	Up to 200μl

3.4.2 37℃孵育2h，分别补加10μl和2μl限制性内切酶Bgl 1至载体和PCR扩增产物反应中，继续酶切2h；

3.4.3酶切结束后，使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化载体和酶切产物，纯化步骤同3.3.2.3；

3.4.4酶切反应纯化后，分别取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度，然后按照下表配制连接反应体系：

试剂	用量
PCR产物	1.6μg
载体	4μg
T4连接酶	30μl
10×T4 reaction Buffer	200μl
ddH2O	Up to 2000μl

3.4.5将上述连接反应4℃过夜（约16h）孵育；

3.4.6酶切结束后，使用通用型DNA纯化回收试剂盒纯化连接反应液，纯化步骤同3.3.2.3，取2μl用核酸浓度测量仪检测回收产物的浓度并记录，4℃保存。

3.5细菌文库构建

将连接产物进行电击转化后构建含有纳米抗体片段的大肠杆菌文库。

3.5.1取100ng回收连接产物，按照以下步骤进行电击转化：

3.5.1.1从-80℃超低温保存箱取出1管SS320大肠杆菌感受态细胞，冰上放置5min使其融化；

3.5.1.2使用提前预冷的枪头加入100ng连接产物，轻轻吹匀，转移到已经预冷的1mm电转杯中，轻敲电转杯，让混合物流至电转杯底部；

3.5.1.3设定1800V，1mm间距，进行电转，完成后立即加入950μl 37℃预温的SOC培养基，将菌液从电转杯中快速取出至1.5ml离心管中，37℃，200rpm震荡复苏1h；

3.5.2复苏后的菌液按使用2×YT液体培养基进行10倍梯度稀释，共稀释6个梯度，即将复苏后的菌液取100μl稀释到1000μl，再从中取100μl稀释到1000μl，依次类推，共稀释10，100，1000，10000，100000，1000000倍；

3.5.3从10倍梯度稀释中每管取100μl均匀涂布到2×YT固体培养基（Amp），37℃静置培养过夜；

3.5.4数出梯度稀释平板上的菌落数目，并使用公式计算连接效率：

3.5.5同时随机挑选平板上的48个单克隆菌，接种于含有氨苄抗性的1ml 2×YT液体培养基（Amp）的离心管中，37℃培养3h，按照下表配制PCR反应并进行单菌落PCR：

PCR反应体系：

试剂	使用量
菌液	2μl
FP/RP	2μl/2μl
dNTP Mix	4μl
10×Taq Buffer	5μl
Taq酶	0.25μl
ddH2O	Up to 50μl

PCR反应条件：

循环	温度	时间
步骤1	98℃	3min
步骤2	94℃	30s
	58℃	30s
	72℃	30s
	转到步骤2	25cycles
步骤3	72℃	3min
	4℃	forever

3.5.6将单菌落PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，目的条带片段大小为600bp的菌落认定为阳性克隆，按公式计算连接产物阳性克隆率：

3.5.7按照3.5.1相同方法进行20个电击转化反应，将复苏后的全部菌液集中至一个15ml摇菌管中混匀，取100μl复苏菌液按照3.5.2-3.5.6方法计算连接效率和阳性克隆率，其余复苏菌液则均匀涂布到5个含有100μg/ml Amp和2%葡萄糖的2%琼脂糖的245mm方形培养基平板中，37℃正置过夜培养；

3.5.8取过夜培养的方形板，在每个培养板表面加6ml 2×YT液体培养基，用涂布棒轻轻将5个方形板菌落刮下并将菌液收集至同一个50ml离心管中，加入终浓度为20%的甘油，即为细菌文库。阳性克隆率为按照3.5.6方法计算出的阳性克隆率，库容量按照公式计算；

3.5.9取20μl上述细菌液到980μl 2×YT液体培养基中并使用分光光度计测量OD600，根据以下公式计算记录细菌文库总OD600；将细菌文库菌液进行分装10管，1ml/管，其余保留在50ml离心管中，-80℃保存；

3.5.10从菌落PCR检测的阳性克隆中随机挑选48个克隆送测序，将测序结果中纳米抗体片段翻译成氨基酸序列后进行序列比对，检测细菌文库中序列多样性。

3.6噬箘体文库构建

3.6.1噬菌体扩增

3.6.1.1从-80℃冰箱中取出细菌文库，冰上融化，根据下面公式计算出相应菌液量，转接到100ml含10μg/ml Tet和100μg/ml Amp的2×YT液体培养基中，以使初始OD600为0.1：

3.6.1.2在恒温摇床中37℃，250rpm培养直至菌液OD600达到0.5-0.55；

3.6.1.3加入辅助噬菌体M13KO7以使细菌个数：噬菌体数=1：20：

3.6.1.4在恒温摇床中37℃，220rpm继续培养30 min；

3.6.1.5分别加入终浓度为50μg/mlKana和终浓度为0.2μM IPTG，恒温摇床中30℃，250rpm过夜培养。

3.6.2噬菌体文库制备

3.6.2.1将过夜培养的菌液转移至新的50ml离心管中4000 rpm，4 ℃离心10min；

3.6.2.2将离心后的上清液转移至新的50ml离心管中，加入1/4体积的4℃预冷的20％PEG/2.5M NaCl，充分混匀后冰上放置30min；

3.6.2.3 4000 rpm，4 ℃离心20 min，弃上清，并在纸上倒置2min；

3.6.2.4加入1ml PBS重悬沉淀，将重悬液移至新的1.5ml离心管，12000rpm，4 ℃离心20min；

3.6.2.5将离心后的上清转移至新的1.5ml离心管，加入1/4体积预冷的20％PEG/2.5M NaCl溶液，混匀后冰上放置10min；

3.6.2.6 12000rpm，4 ℃离心10min，弃上清，加入1ml PBS重悬沉淀；

3.6.2.7 12000rpm，4 ℃离心2min，将上清转移到新的1.5ml离心管中，即为噬菌体文库，100μl /管分装，长期-80℃保存，短期（1-2周）可于4℃放置保存。

3.6.3噬菌体文库效价检测

3.6.3.1将-80℃冰箱保存的SS320菌株在2×YT固体培养基（Tet抗性）进行单菌落划线，37℃过夜培养（4℃保存一周），从单菌落板上挑取一个单菌落到5ml含有10μg/ml Tet的2×YT培养基，37℃过夜培养；

3.6.3.2取过夜培养菌液250μl转接到含5ml含有10μg/ml Tet的2×YT液体培养基中，37℃，250rpm培养约45min-60min后至OD600为0.5-0.55；

3.6.3.3取3.7.2方法制备好的噬菌体文库10μl，在1.5ml离心管中10倍梯度稀释，共稀释12个梯度，即将噬菌体文库取10μl稀释至100μl，再从中取10μl稀释至100μl，依次类推，共稀释12个梯度至10-12，振荡混匀；

3.6.3.4在每个稀释离心管中加入90μl的SS320菌液，混匀后37℃孵育30min；

3.6.3.5从每个稀释离心管中取5μl滴加到2×YT固体培养基（Amp）中，37℃过夜培养；

3.6.3.6统计板上可以明显区分单菌落的稀释度的单菌落数量，并按照下面公式计算每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量，即噬菌体文库效价。

4.    实验结果

4.1总RNA提取和反转录

4.1.1总RNA琼脂凝胶电泳结果：

 

图1羊驼PBMC总RNA琼脂糖凝胶电泳结果

4.1.2反转录cDNA结果：

4.2 PCR扩增

4.2.1第一轮PCR扩增

4.2.1.1确定最佳扩增模板量

琼脂糖凝胶电泳结果显示，oligo dT Primer转录后进行第一轮扩增使用2μl作为模板扩增条带强清晰且无杂带，选择2μl为最佳扩增模板量；random 6-mers转录后进行第一轮扩增使用2μl作为模板扩增条带清晰且无杂带，选择2μl为最佳扩增模板量。

图2使用不同cDNA模板量的琼脂糖凝胶电泳

4.2.1.2第一轮PCR扩增和回收

引物	项目	值
Oligo dT Primer	单个反应模板量	2μl
	反应个数	130
Random 6-mers	单个反应模板量	2μl
	反应个数	130
合并后	回收后DNA体积	1080μl
	回收后DNA浓度	55.5 ng/μl
	回收后DNA总量	59.9ug

4.2.2第二轮PCR扩增

4.2.2.1确定最佳扩增模板量

琼脂糖凝胶电泳结果显示，第二轮扩增使用0.1μl作为模板扩增条带清晰且无杂带，选择0.1μl为最佳扩增模板量。

图3使用不同的第一轮PCR产物模板量的琼脂糖凝胶电泳

4.2.2.2第二轮PCR扩增和回收

	项目	值
	每个反应模板量	0.1μl
	反应个数	576
合并后	回收后DNA体积	2760μl
	回收后DNA浓度	241.4ng/μl
	回收后DNA总量	666.3μg

4.3载体和PCR产物酶切、连接

4.3.1酶切、连接检测结果

	项目	值
载体酶切回收	使用载体量	10μg
	回收后体积	50μl
	回收后浓度	80.7ng/μl
	回收后总量	4.0μg
PCR产物酶切回收	使用PCR产物量	4μg
	回收后体积	50μl
	回收后浓度	55.5ng/μl
	回收后总量	2.8μg
连接产物回收	回收后DNA体积	50μl
	回收后DNA浓度	114.1ng/μl
	回收后DNA总量	5.7ug

4.4细菌文库构建

4.4.1细菌文库检测

项目	值
连接效率	1.2×108pfu/100ng
库容量	2.3×109pfu
阳性克隆率	96%
细菌库体积	50 ml
细菌库OD600	77.88

4.4.2阳性克隆率菌落PCR

菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示，挑选的55个单克隆有53个为阳性克隆，阳性率为96%，细菌文库阳性克隆率符合要求。

图4菌落PCR琼脂糖凝胶电泳结果

4.4.3序列多样性

随机挑选48个单克隆测序后使用GENtle软件转录翻译成蛋白质序列，序列多样性比对显示48个序列均为独立序列，多样性100%，细菌文库多样性符合要求要求。

图5序列多样性比对

4.5噬箘体文库制备

4.5.1噬菌体文库检测

项目	值
体积	1.0 ml
效价	4.8×1012pfu/ml