理想表达宿主——E.coli表达系统

重组 DNA 技术和异源蛋白表达为简化高纯度目标蛋白的生产及大规模试剂盒的开发提供了可行性途径，极大地推动了生命科学研究、诊断、治疗技术的发展。其中，抗体和抗体衍生分子作为高级诊断和治疗的关键试剂不断得到开发，诸如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、细菌、转基因动物，藻类等各种宿主的表达系统都被用于重组抗体的表达。糖基化对于全长抗体功能和结构的发挥至关重要，必须用到哺乳动物细胞表达系统，但对大多数抗体片段和抗体样分子而言，是不需要糖基化修饰的，所以，可以考虑生长更为迅速、表达水平更高的大肠杆菌作为重组蛋白表达宿主。据研究统计，用于医疗保健的重组蛋白中，大约有30%的蛋白是在大肠杆菌中表达的。

大肠杆菌作为抗体表达宿主的特点

自 Escherich 最初发现大肠杆菌（E.coli）以来，E.coli就成为分子生物学家最重要的工具之一。与酵母和或哺乳动物细胞相比，大肠杆菌具有清晰且简单的遗传背景，易于基因工程改造，且快速生长、培养廉价。用做蛋白表达系统具有培养条件简单、宿主菌繁殖快、蛋白表达水平高等优势。研究表明，大肠杆菌培养的理论密度极限约为 200 g 干细胞/L，相当于约1 × 10 ¹³ 个活菌/mL。

E.coli系统中的大多数蛋白质在细胞质中表达，异源蛋白，特别是对于具有二硫键的蛋白，经常被错误折叠。很多时候，需要最佳的HC和LC比例以及蛋白质折叠率才能实现抗体片段的最佳表达。此外，还可以通过在 N 端使用信号肽（例如 SpA、PhoA、PelB、OmpA、OmpT、DsbA、TorT 和 TolT）将蛋白质表达重定向到大肠杆菌周质，利用周质的氧化环境以实现二硫键的稳定形成。多个研究小组研究了Fab 与分子伴侣共表达的重要性，并可增加 Fab 抗体片段的可溶性表达。分子伴侣是一类普遍存在的折叠调节剂，在蛋白质组的构象质量控制中起着至关重要的作用，有助于非天然多肽的正确非共价组装。

常见的抗体片段

与全长抗体相比，抗体片段具有多种药代动力学优势，包括更好地渗透到组织中、更短的半衰期以及较低的免疫原性等。目前，单结构域抗体片段 (dAbs)、抗原结合片段 (Fab) 和单链可变片段 ( scFv) 是使用最为广泛的几种抗体片段。

单结构域抗体片段 (dAbs)

单域抗体是指一类在骆驼科动物体内发现的天然缺失抗体轻链和重链恒定区的重链抗体，具有尺寸小、结构简单且亲和力高、免疫原性和毒性较低等优点。序列中部分疏水残基被亲水残基取代，水溶性好，不易形成聚集体。单域抗体药物形式可拓展性较强，可以相互结合成多价分子、多特异性分子或与其他化合物结合形成药物载体，再加上优异的物理化学稳定性，都给单域抗体带来了巨大的药物开发前景。目前开发的单域抗体药物大多通过多分子聚合、偶联或结构修饰的设计以延长半衰期。

抗原结合片段 (Fab) 

Fab是抗体结构中可以与抗原结合的区域。由于Fab同时具备了抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备了单链抗体（scFv）一样的抗体-抗原亲和力、优秀的组织穿透力等，并拥有更稳定的结构，从而在临床诊断和治疗上发挥巨大的作用。与完整的IgG相比，Fab片段缺少Fc段，不会与抗原发生沉淀反应；由于自身免疫原性低，不能被活体的免疫细胞识别，因此能显著降低超敏性反应发生的概率，提高产品的安全性。Fab类抗体片段具有抗体亲和力、稳定性较高、免疫原性低、半衰期短，可基因工程操作等特点。

单链可变片段 ( scFv)
scFv是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15-20个氨基酸的短肽连接而成，不含Fc片段，属于小分子基因工程抗体。与单克隆抗体相比，单链抗体分子尺寸小、血液清除快速，并且对人体免疫系统的负面反应更少，因此作为放射性核载体和肿瘤药物载体时，可以产生更大的肿瘤渗透性。scFv在抗病毒、肿瘤治疗、靶向药物治疗、治疗学或诊断学领域具有广泛的应用前景。

E．coli蛋白表达系统常用表达载体的特点

质粒通过不同DNA 元件组合以形成具有不同功能的载体。

1. 一个有效的载体必须包含最重要的复制起点（ORI）。这是基因组序列开始复制的地方，并可以决定该质粒适用于什么目的、什么类型/种类的宿主以及质粒拷贝数等。
2. 启动子的选择决定了调节蛋白质表达的机制。一个有效的启动子应该能够实现重组蛋白的积累高于总细胞蛋白的 10-30%。并且，大多数表达载体采用诱导型启动子系统，即在常规情况下，表现出最小的基础转录活性。在特定条件下能够实现简单和廉价的诱导。诱导点对于最大限度地提高重组蛋白产量至关重要,通常进行生长曲线绘制以确定诱导前的最佳生长时间。
3. 抗生素抗性基因允许进行目标菌株细胞选择，将这种特定抗生素添加到培养液中会抑制不携带所需质粒的细胞的生长。

4. 不同标签的组合，蛋白表达中常用到的融合标签一般分为纯化标签和溶解标签。亲和标签能够用于快速有效地纯化蛋白质，而溶解度标签可增强蛋白质的正确折叠和溶解度。

pET载体系统是用于在大肠杆菌中表达重组蛋白的功能强大且广泛使用的系统，使用受lac控制的T7启动子操纵子，T7强启动子能够调控目的基因的转录和翻译。通常情况下，重组蛋白的表达量可达到总蛋白量的50％，且在没有添加IPTG的情况下，目的基因的表达状态非常稳定，适用于大部分基因。pBAD表达系统通过对特定碳源（葡萄糖、甘油、阿拉伯糖）的调控从而实现蛋白质的滴度表达。pBAD非常适用于在大肠杆菌中进行毒性蛋白质的表达及优化蛋白质的可溶性。

图1 A typical plasmid map for the expression of recombinant antibody in E. coli

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参考文献

1. Sandomenico A, Sivaccumar JP, Ruvo M. Evolution of Escherichia coli expression system in producing antibody recombinant fragments. Int J Mol Sci. 2020; 21:1–39.
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