放线菌检测方法

一、 检测用培养基配方与培养条件

1. 培养基：高氏1号培养基

配方：可溶性淀粉 2g ，KNO3 0.1g ，K2HPO4 0.05g ，MgSO4• 7H2O 0.05g ，NaCl 0.05g ，FeSO4• 7H2O 0.001g (母液) ，琼脂 2g ，自来水 100mL 。

先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。

2. 培养条件： 温度：27℃-30℃;时间：36--48小时。

二、检测与计数方法

1. 系列稀释

称取适量的样品，加入带玻璃珠的三角瓶中，加入100mL的无菌水(无菌水中事先加入了分散剂1—2滴，分散剂可以是吐温，OP—10，用来分散菌团)，用玻璃棒搅拌使之溶解吸水均匀后上旋转式摇床200 r/min充分振荡40—60 min，,即成母液菌悬液(基础液)。

2. 用1mL无菌移液管分别吸取1.0mL上述母液菌悬液加入9 mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……1:1×k稀释的菌悬液(每个稀释度应更换无菌移液管)。

3. 加样及培养

取1个适宜的稀释度，用移液枪吸取菌悬液0.1 mL，加至预先制备好的固体培养基平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。此稀释度重复3次，同时以空白作对照，于适宜的条件下培养。

4. 菌落识别

根据所检测菌种的技术资料，每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时，检测结果无效，应重做。

5. 菌落计数

以出现20—150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数目和杂菌数目。有效菌平均菌落数在20—150之间时，则以该菌落数计算。

有效活菌数按式(1)计算，同时计算杂菌数：

nm = kv1/(m0v2) ×10-8 或 nv = kv1/(v0v2) ×10-8 (1)

式中：

nm — 质量有效活菌数， 亿/g

nv — 体积有效活菌数， 亿/mL

— 有效菌落平均数， 个

k — 稀释倍数

v1 — 基础液体积， mL

v2 — 菌悬液加入量， mL

v0 — 样品量， mL

m0 — 样品量， g

重点需要注意的部分在菌悬液的制备及震荡过程上，因为固态发酵的的产品大部分为聚集状态不容易分散开来，这点与液态发酵产品不同。所以：

① 悬液中要加分散剂分散菌团;

② 震荡时间也要较液态发酵产品时间长，使用旋转式摇床控制在180——200r/min 。

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