细胞培养及牛血清使用中的常见问题和解答

目录

细胞培养前的准备

• 如何选用合适的细胞培养基？
• 如何选用合适的血清？
• 怎么保存和解冻血清？
• 血清是否必须要热灭活？
• 如何正确热灭活？
• 为什么血清灭活后瓶底会出现胶状物质？

 

细胞培养常见问题

一、若要更换培养基/血清，如何让细胞适应新的培养条件？

二、如何避免实验室环境对细胞的影响？

三、细胞复苏、冻存注意事项？

四、为什么血清中常会有沉淀？主要是哪些物质？

五、血清中为什们会出现“小黑点”？

六、哪些情况会造成血清中的沉淀增多？

七、我的细胞污染了，是什么原因？怎么办？

八、我的细胞死亡了，什么原因？怎么解决？

九、EDTA在细胞消化过程中起什么作用？

十、如何用台盼蓝计数活细胞？

十一、若添加L-谷氨酰胺后，培养基的有效期如何？

 

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细胞培养及牛血清使用中的常见问题和解答

 

 

一、为什么血清中常会有沉淀？主要是哪些物质？

在使用血清时常常会遇到各种沉淀问题，主要可能会存在以下种类的沉淀物：

1、纤维蛋白：实验室人员血清化冻后发现有絮状沉淀，它是由纤维蛋白的凝聚产生，对血清质量没有任何影响。纤维蛋白是最常见的沉淀物，肉眼可观察的到，直径达到1-2mm。纤维蛋白的析出与血清冻存时间、化冻次数、化冻方式等有关，属正常现象，不影响细胞培养。

2、盐析出（如磷酸钙），也是常见沉淀物之一，镜下观察可见晶体或者小黑点，并且在37℃培养的时候会增加，这些小黑点由于布朗运动看上去像是在活动，因此经常被误认为是微生物污染。

3、胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。

 

二、血清中为什们会出现“小黑点”？

在培养细胞的过程中所发现的“运动微生物”，国内研究者习惯叫作“黑胶虫”或“焦虫”。早在1992年就有人提出在细胞培养中发现此小黑颗粒。它可以在400倍显微镜或更高倍镜下观察到，在显微镜下是半透明的圆点，分布在细胞间隙，作上下翻转运动。

经过热灭活的血清，沉淀物的形成会显著增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更加增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。此小颗粒在细胞培养过程中有增多的现象，但培养液不混浊，细菌、真菌等微生物检查均为阴性，对细胞的影响程度根据细胞种类和状态的不同不完全相同，这些小颗粒是因血清中的蛋白质凝聚析出造成的，对细胞的培养效果总体影响不大。

 

三、哪些情况会造成血清中的沉淀增多？

血清中出现沉淀虽然是属于正常物理析出，但以下处理会使沉淀增多，如热灭活、长期在不适宜的温度环境中存放、γ射线照射、配制试剂时pH的变化等。所以应正确使用血清，避免出现过多的沉淀物。

 

四、血清是否必须要热灭活？

血清热灭活目的主要是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，但是在胎牛血清中对补体的灭活则明显没有必要，所以多数细胞培养过程中血清的热灭活并不是必须的。很多情况下，热灭活并不会改善细胞的生长，却降低了支持细胞生长的能力。即使在少数有促进的情况下，其促进的比率也是微不足道。另外，血清的热灭活导致的沉淀常常被认为是微生物污染，从而给用户和供应商都带来不必要的麻烦。因此建议，对血清进行灭活的用户，需要通过试验来证实其必要性。

 

五、如何正确热灭活？

若确定需要灭活，将正常化冻后的血清置于56℃水浴中灭活30分钟，并通过摇晃使其受热均匀。

 

六、为什么血清灭活后瓶底会出现胶状物质？

血清灭活后出现的沉淀大多数是纤维蛋白析出，属正常现象。灭活过程多次摇晃使血清受热均匀可以降低蛋白的析出，但当血清在未完全化冻状态时直接置56℃水浴、灭活过程中局部受热过高、加热时间过长就会产生胶状沉淀，这样的血清质量严重受损，是无法继续正常使用的。

 

七、我的细胞污染了，是什么原因？怎么办？

1、细胞培养污染由细菌、真菌、支原体、噬菌体及其他病毒等造成，主要有以下几个原因：

（1）人为操作污染；

（2）环境污染：超净工作台、层流空气；

（3）细胞、培养基、胰蛋白酶、牛血清、PBS等；

（4）与培养基直接接触的器具：移液管、吹管、移液枪枪头、培养的容器等。

    2、若怀疑出现微生物污染时，可采取以下措施：

（1）肉眼观察培养基是否浑浊，然后镜下观察初步确认是否污染；

（2）用细胞培养物分别接种到细菌、真菌等专门的微生物培养基中进行培养，最终确认是否是微生物污染。对环境进行沉降菌及尘埃粒子检测，排除环境污染原因；

（3）一旦确认发生污染，应确认污染的真正原因防止二次发生，然后应对环境进行彻底消毒，相关器具、试剂、培养基停止使用，重新配制试剂培养基，对相关操作人员进行培训，然后重新复苏细胞。

 

八、我的细胞死亡了，什么原因？怎么解决？

1、通常在培养过程中，出现细胞死亡的现象，主要有以下原因：培养基选择不当、血清选择不当、pH不适宜、培养箱内温度波动太大、细胞冻存或复苏过程中损伤、培养液渗透压不正确、培养液中有毒代谢产物堆积、胰蛋白酶消化过度、微生物污染、细胞老化等。

    2、 建议解决方法：

1. 检查培养箱内CO₂ 是否符合培养要求 ，调整培养基pH值；
2. 检查培养箱内温度，尽量选择水套式培养箱，保证稳定的培养温度；
3. 规范冻存、复苏流程，取新的保存细胞，建立细胞种子库和工作库，及时冻存状态较好的细胞；
4. 检测培养液渗透压；
5. 及时更换新鲜培养液；
6. 合理控制消化时间或降低胰蛋白酶浓度；
7. 参照本文（七、2、疑似微生物污染时采取的措施）；
8. 重新复苏细胞，规定细胞使用代次。

 

九、怎么保存和解冻血清？

建议收到血清后根据外包装说明，通常保存在-10～-30℃温度条件下，可保存五年。若将血清从冷冻箱取出后，置于2～8℃冰箱使之缓慢融解，一般过夜融解。如果一次无法用完整瓶血清，可以根据使用情况将血清分装至多个无菌的容器中，冷冻保存。若化冻后置于2～8℃环境中建议在两周内使用完。

 

十、若要更换培养基/血清，如何让细胞适应新的培养条件？

应采取逐步替换的方法：通过1:2、1:1、2:1（新、旧培养基V/V，且保证替换过程中细胞可以稳定传代，才可以进行下一步替换），最终用新的培养基完全替换。该过程中最好保留一瓶完全由最初的培养基培养的细胞，并将替换过程中表现较好的细胞扩增冻存，防止细胞适应失败，降低风险，加快实验速度。

 

十一、EDTA在细胞消化过程中起什么作用？

EDTA是一种螯合剂，它可以螯合Ca²⁺ 或Mg²⁺，而细胞表面很多和培养皿或培养瓶结合的蛋白都是带有Ca²⁺ 或Mg²⁺的，把这些离子螯合后，可以加速细胞和培养皿的脱离，促进消化。在胰酶与EDTA同时使用，可以使细胞更好地分散成单个细胞。

 

十二、如何用台盼蓝计数活细胞？ 

制备细胞悬液，在0.2ml的细胞悬液中加入0.2ml的0.4%的台盼蓝溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼蓝，因而染成蓝色的细胞是死细胞。

 

十三、若添加L-谷氨酰胺后，培养基的有效期如何？

L-谷氨酰胺在细胞培养时可作为培养细胞的能量来源，参与蛋白质的合成和核酸代谢。它在溶液中经过一段时间后会自然降解，并导致氨的形成，而氨对于细胞具有毒性。因此，应在培养基使用前添加L-谷氨酰胺，并尽快使用。

 

十四、如何选用合适的细胞培养基？

选用合适的细胞培养基有以下几个原则：首先，选择细胞建株时的培养基，这个阶段使用的培养基一般为基础培养基添加一定量的血清，可以通过细胞获得途径或购买途径获得相应的细胞培养基信息；其次，根据细胞株和培养工艺的特点选择合适的培养基，这个阶段培养基里就会添加一些营养成分来弥补基础培养基和血清中某些营养成分不足，可以通过相关实验室经验和相关的文献中获得相应的细胞培养基信息；第三，根据细胞用途选择培养基，这个阶段的目的是细胞培养基的选择开始呈现多元化趋势，要进行大量的筛选和细胞驯化，才能得到最理想的培养基，可以通过与国内外的细胞培养基供应商沟通获得相应的信息。

 

十五、如何选用合适的血清？

因为血清的成分复杂使得选择血清过程可能会出现各种问题。选择血清最简单、便捷、快速的方法就是提供详细的细胞株和用途信息，向血清供应商相关技术人员进行咨询；其次，选择营养成分最高、抗体含量较低的胎牛血清进行实验，再根据实验情况，逐步替换其它品质血清。因为血清天然成分和来源的原因，造成血清存在批间差异，如果找到适合实验用的的血清，可储存同一批号血清，不要随意更换血清批号，避免实验的延续性造成影响。

 

十六、细胞复苏、冻存注意事项？

细胞复苏注意事项：

1. 复苏最好在37-38℃水浴中进行，复苏过程要快速摇晃，使细胞受热均匀且快速融化，同时做好防护措施（如佩戴护目镜、手套等），防止细胞复苏过程中冻伤或因冻存管破裂炸伤；
2. 在细胞融化至还有一点冰未融化时，将细胞悬液加入无菌离心管中，同时补加一定量的新鲜培养液，在800-1000RPM下离心3-5分钟；
3. 将无菌离心管上清吸出，再加入新鲜培养液进行重悬，将细胞吹散后加入培养容器中，过程中注意培养液pH不要过高，防止对细胞造成损伤。

 

细胞冻存注意事项：

1. 根据细胞复苏使用容器和体积确定细胞冻存数量；
2. 根据血清的主要功能，建议冻存过程中添加血清量要≥平时添加血清量；
3. 冻存细胞过程：室温→4℃（0.5-1h）→－20℃（2-4h）→－70℃（过夜）→液氮（注意过程中要确保细胞完全达到所处环境温度，才能快速的转移到下个温度保存，并做好记录。）

 

十七、如何避免实验室环境对细胞的影响？

    实验室细胞培养阶段不同于工厂，有很多的不确定性，出现细菌污染和交叉污染的几率比较大，为避免该现象的发生，在保持实验室良好实验环境的同时，还要对仪器设备及实验环境进行监控。应定期（建议每周）使用培养基平皿对超净工作台和相关实验室进行沉降菌、浮游菌和尘埃粒子检测，一定要最大限度的衡量实验室环境的微生物水平，特别是在超净台下进行无菌实验操作时，更需要通过环境监测手段来评估超净台的微生物污染状况，以免造成污染。

 

 

 

本手册收集了科研用户在细胞培养过程中遇到的常见问题，并给予了解答，希望对您的实验有所帮助。

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