多领域快速检测利器——qPCR检测技术

实时荧光定量PCR(qPCR)具有许多潜在的应用，可广泛应用于诊断病毒学，新型冠状病毒COVID-19快速检测、水传播污染、食品霉菌污染、植物内源病毒等多领域检测。具有特异性好、灵敏度高、快速、适用样品种类多、重复性好等优点，是较为理想的检测方法。

应用一：病毒检测

核酸检测是诊断病毒感染的主要依据和手段。目前用于RNA病毒的核酸检测技术主要有基因测序、RT-qPCR检测、基因芯片和恒温核酸扩增等。RT-qPCR检测可以通过检测呼吸道分泌物中特异性片段的扩增来定性判断是否感染病毒。此外，该检测方法还可以检测多种临床样品，例如血液、痰液、支气管肺泡灌洗液、咽鼻拭子、粪便等。RT-qPCR为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。

图1 新型冠状病毒的qPCR检测

RT-qPCR检测是目前RNA检测的金标准，由于大流行性病毒的威胁日益增长，对快速和简单有效地检测RNA目标的需求越来越高。基于RT-qPCR检测的基础上，可利用热响应性材料的可控释放体系，建立了一步实时逆转录-聚合酶链反应(One-step RT-qPCR)，使高保真RNA分析成为抑制副产物。采用tPIN系统进行多重一步RT-qPCR，所有流感病毒按亚型一次分析成功。新的平台不局限于特定的靶点，它可以广泛用于RNA和DNA靶点精确诊断。可对流感病毒的可扩展多重分析显示了一步式RT-qPCR平台的广泛用途。

图2 多重一步RT-qPCR适合tPIN检测流感病毒及亚型

应用二：环境检测

RT-qPCR 还可快速检测水污染问题，水传播疾病是全球重视的公共卫生问题。为了控制通过受污染的水感染病毒的潜在风险，需要一种快速、可靠的工具来评估致病性病毒的传染性。即RT-qPCR方法可以区分完整的病毒和灭活病毒。利用这个方法，样品在RT-qPCR之前用单叠氮染料或金属化合物试剂预处理，处理后，仅对完整的病毒基因组进行扩增及RT-qPCR检测。确定病毒的消毒机制，或识别病毒是否因衣壳或基因组结构受损而失活，可以作为评估环境水域中各种病毒壳体完整性的可靠工具。

图3 利用单叠氮染料或金属试剂结合RT-qPCR对完整病毒与灭活病毒及其游离RNA/DNA进行鉴别

应用三：微生物检测

RT-PCR 检测方法除了可以作为病毒检测手段、水污染传播快速检测，还可对食品类霉菌现象和植物内源病毒进行筛查检测。坚果类食品霉菌超标现象较为严重，曲霉属、青霉属和镰刀菌属是坚果霉菌污染的主要污染菌群。研究人员根据其内转录间隔区（ITS）基因序列，设计3对引物及特异性分子信标探针，建立了针对坚果中的曲霉属、青霉属和镰刀菌属的三重qPCR检测体系，为坚果中霉菌的检测提供快速准确的方法。分子信标法qPCR具有高特异性，不仅可以避免涂布平板法耗时长的问题，也能有效排除普通 PCR 无法进行定量检测的局限性。目前分子信标法qPCR已成功用于多种食源性致病菌的检测，本方法相较于国标法的真菌培养检测方法缩短了3~4 天，对实际样品中霉菌的准确高效定性定量检测具有一定的指导意义。此外，甜瓜内源病毒（cucumis melo endornavirus，CmEV）是近年来发现的寄主广泛、发病率高、种传率高的重要病毒之一。Zeng 等研究人员在2020年利用甜瓜内源病毒序列信息设计特异性引物和探针，建立了基于RT-qPCR的检测技术，该技术可以扩增长度为710 bp的序列，能够实现CmEV 的初步检测。CmEV TaqMan RT-qPCR检测技术能够检测出1×10-2 ng·μL-1的甜瓜RNA样品以及1.8×103 copies·μL-1 的质粒溶液，其灵敏度是常规RT-PCR检测技术的100倍。

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泓迅科技深耕于寡核苷酸合成领域，以出色的合成品质和稳定性服务于全球科研及工业用户，提供qPCR、NGS、RNAi等一站式解决方案。泓迅科技不断优化升级寡核苷酸生产工艺，最大限度的分离小分子荧光、失败的小分子片段和目标产物，纯化效果达到业内领先水平。合成的qPCR探针具有较高的纯度及灵敏度，可完美匹配您下游应用需求。

质检结果显示，泓迅科技制备的高质量探针，MS检测与理论分子量相同且无N士峰，HPLC检测纯度高达98%以上，荧光全波长扫描与对应参数一致

服务详情

保存方式：引物冻干粉4℃或常温稳定保存两周，-20℃至少保存一年。含荧光修饰引物注意避光。风险提示：引物溶解前请高速离心片刻保证引物干粉置于管底；引物溶解后请避免反复冻融。

qPCR实验小课堂

qPCR探针设计的一般规则有哪些?
1）扩增片段的长度不应太大，一般小于300bp；2）探针不能和任一引物互补，且其长度在保证特异性的前提下尽可能的短，长度不要超过30bp；3）探针的Tm值至少比引物的Tm值高5度；4）探针如用于检测多态位点，多态位点应尽可能靠近探针中部；5）探针5’端不能是碱基G，G对荧光基团有猝灭作用。

参考文献

1. Victor M Corman , Olfert Landt , Marco Kaiseret al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR [J]. Eurosurveillance. 2020.

2. Junsun Kim, Seungwon Jung, Mi Yeon Kimet al. Thermo-Responsive Polymer Capsules in Real-Time One-Step RT-PCR for Highly Multiplex RNA Analysis [J]. Adv. Healthcare Mater. 2020, 1900790.

3. Canh Vu Duc,Liu Miaomiao,Sangsanont Jatuwat et al. Capsid integrity detection of pathogenic viruses in waters: Recent progress and potential future applications [J] . Sci Total Environ, 2022, 827: 154258.