文献解读 | 单核RNA和ATAC测序揭示了染色质可及性对拟南芥根部单细胞水平基因表达的影响

植物由多种多样且特化的细胞类型组成，不同细胞类型的独特生物学功能的获得是细胞类型特异性转录程序建立的结果。本研究对拟南芥根进行单核RNA测序(sNucRNA-seq) 和单核转座酶可及染色质测序 (sNucATACseq) 测序，与已发表的原生质体转录组进行比较，验证了使用细胞核作为生物实体来建立植物细胞类型特异性转录组的可行性。sNucRNA-seq的结果揭示了单细胞RNA测序未能识别的额外细胞亚型的转录组。与转录组方法类似，sNucATAC-seq方法也使得拟南芥核能够根据细胞身份的不同，被分入不同的簇，表明染色质的可及性在不同细胞群之间存在差异。为揭示染色质可及性对基因表达的影响，研究人员整合了sNucRNA-seq和sNucATAC-seq数据，并证明了细胞类型特异性marker基因显示出细胞类型特异性的染色质可及性模式。数据表明，差异性的染色质可及性是调控细胞类型水平上基因活性的关键机制。

sNucRNA-seq、sNucATACseq

1.拟南芥根单细胞核转录组数据集

使用10X Genomics Chromium平台对10548个拟南芥幼苗根的细胞核的转录组进行了测序，通过与Ryu等人（2019)的研究进行比较，发现原生质体中表达的基因中位数和共检测到基因数都高于细胞核。研究人员认为，原生质体中检测到的表达基因数量较多是由于细胞中聚腺苷酸化转录物的积累和相对稳定性。为评估从细胞核数据获得的核转录组的生物学意义，通过相关性分析表明，拟南芥根的单细胞核转录组与整个根的转录组以及基于原生质体的转录组高度相关，基于汇集的拟南芥根细胞核的单核转录组能够很好地反映传统方法生成的预期根转录组。

将拟南芥根细胞核与原生质体根据转录组谱进行共聚类，结果表明细胞核和原生质体分别被聚类为21个和20个不同的簇。其中，有两个簇几乎完全由细胞核代表(簇4和11)，一个簇（簇14）仅通过细胞核技术表征(图1A-B)。为进一步评估细胞核方法的生物学相关性，比较了在20个共表征集群中使用细胞核和原生质体技术，结果表明，结合细胞核和原生质体技术检测到73.7％的蛋白质编码基因，并且除了簇14外，两种技术识别的百分比没有显著差异(图1C)。此外，通过识别三个新的细胞集群，表明单细胞核方法比原生质体捕获到更具多样性和代表性的拟南芥根细胞类型群体。

2. 拟南芥根部细胞类型注释

研究人员利用拟南芥根单细胞转录组数据以及有关根基因表达和调控的信息，创建了一个包含101个细胞类型marker基因的列表。根据这些基因注释出毛状细胞、非毛状细胞、分生细胞、皮层细胞、内胚层细胞和中柱细胞共6种细胞类型，还能够确定韧皮部和木质部集群（图2A）。

与之前报道中提到的t - SNE 技术相比，UMAP 技术生成的集群拓扑结构揭示了细胞和细胞核在细胞类型内部和之间的功能组织(图2A)。例如，根的分生细胞(即簇 8 - 10)位于 UMAP 图的中心(图2A)。从这些分生细胞起源，一些细长的细胞投影(如集群 3、6、7、12 和 13)以更球形的集群(如簇 1、2、5、11、15 和 18)结束(图2A)。细长的集群可能反映了细胞分化过程中转录组程序发生的渐进变化，而球形集群代表了构成拟南芥根的分化细胞。

3. 单细胞分辨率ATAC-seq揭示染色质可及性对基因表达的影响

为更好地评估染色质可及性在控制细胞和细胞类型之间植物基因表达方面的影响，研究人员用10X Genomics sNucATAC - seq 技术对拟南芥根细胞核进行测序。总共鉴定了20 803个可访问位点，并观察染色质的可及区域主要位于包含顺式调控元件的转录起始位点 (TSS)上游1000 bp窗口内(图3A)以及基因的转录终止位点(TTS)附近(图3B)。可及染色质位点是促进基因表达的先决条件，整合 sNucATAC - seq和sc /sNucRNA - seq分析，鉴定出了11858个具有配对RNAseq和ATAC-seq峰值的基因，并创建了与 sc/sNucRNA-seq 簇相对应的21个sNucATAC-seq簇（图3C）。sNucATAC-seq 根细胞簇的UMAP拓扑结构与 sNuc/scRNA-seq 簇相似，且相关簇的分布位置也相似，未分化簇位于 UMAP 图的中心，分化细胞相关的簇位于外围。这表明，染色质可及性和基因表达都可以作为标记植物细胞类型的分子标记，并且支持染色质可及性与某些基因的转录活性之间存在相关性的一些实例。

为更好地评估sNucATAC - seq与bulk ATAC - seq数据集分辨率的提升，以及sNucATAC - seq技术揭示染色质可及性离散变化的潜力，研究人员比较了在拟南芥根细胞核同一位置生成的sNucATAC - seq和bulk ATAC - seq图谱(图3D)。在21个簇中，能清楚地识别出bulk ATAC - seq技术揭示的相同主要峰值，此外，sNucATAC - seq方法还揭示了额外的主要峰值，但仅在21个簇的子集（如AT1G56320基因的启动子区域）中（图3D-E）。这表明单细胞分辨率的ATAC - seq分析有可能揭示可及染色质的离散和细胞类型特异性位点，且21个sNucATAC - seq簇具有开放染色质位置的独特组合特征。

4. 染色质可及性与基因表达模式相关性分析

为揭示 sc/sNucRNA-seq和sNucATAC-seq实验的对应关系，研究者对拟南芥marker基因表达与 TSS处染色质可及性进行相关性分析。从每个簇中选出top 20个marker基因，共确定了370个独特标记基因，其中336个在 TSS 附近有至少一个 sNucATAC-seq峰值。此外，还对 811个拟南芥根管家(HK)基因和336个基因的三个随机子集进行了类似分析。

通过对marker基因和HK基因表达模式及峰值分布进行归一化后，根据转录活性和染色质可及性特征，将它们分布在20个不同的区间。对标记基因进行 Kendall's taub秩相关检验，发现几乎所有共注释的sc/sNucRNA-seq和sNucATAC-seq数据集之间存在显著正相关(图4A-B)。这表明差异染色质可及性与至少部分簇marker基因的表达模式相关，同时也说明单细胞核转录组与单细胞转录组在生物学上具有相关性。基于这些结果，研究人员认为所选基因TSS位置的染色质可及性可作为细胞类型身份的分子标记。

5. ATAC-seq揭示的单细胞分辨率染色质可及性可用作指示根毛和内胚层细胞发育状态的分子标记

植物单细胞类型通常基于marker基因的表达谱进行注释。基因表达与染色质可及性的相关性分析(图4)表明，染色质可及性也可作为拟南芥根细胞类型的另一种分子标记。为进一步验证这一假设，研究人员利用单细胞分辨率的ATAC - seq数据集，重点分析了代表成熟拟南芥根毛和内胚层细胞的三个和四个簇(图 2A，即簇 1、2、3 和簇 13、14、15、16)。通过寻找在根毛和内胚层细胞簇中优先识别的sNucATAC - seq峰值，以及挖掘scRNA - seq 和sNucRNAseq 数据集，确定了分别在根毛和内胚层细胞中优先表达的19(95%)和25(96.2%)个基因(即这些基因在根毛或内胚层超级簇中的表达至少等于在其余五个簇中的表达，图5A-B)。

研究成功验证了分离的植物细胞核能够用于获取生物学相关的转录组信息。在单细胞水平上实现了转录组和染色质可及性数据集的全面整合。这种方法为探索细胞分化、伸长及不同细胞类型间的动态转录组变化开辟新途径，并且应用于不同植物物种时可进行更有针对性的比较分析，揭示单细胞类型水平上基因表达的进化。