一起学习吧 | 蛋白质纯化技术“了解了解”？

蛋白质粗提物是指从含有目标蛋白质的生物材料中提取出的未经进一步分离和纯化的蛋白质混合物。

初提物的制备方法取决于目标蛋白质的来源和位置，例如：

• 如果目标蛋白质是肌肉蛋白质，可以将肌肉组织磨碎或切割，然后用适当的缓冲液和抑制剂悬浮和匀浆，得到肌肉匀浆液。

• 如果目标蛋白质是细胞内蛋白质，可以将细胞培养物或组织样本用机械或化学方法破坏细胞壁和膜，释放出细胞内的内容物，得到细胞裂解液。

• 如果目标蛋白质是血液蛋白质，可以将血液样本用抗凝剂处理，然后用离心或沉淀法分离出血浆或血清。

在进行蛋白质粗提物的制备过程中需要注意以下几点：

• 使用合适的缓冲液和抑制剂，以保持目标蛋白质的稳定性和活性，防止其变性、降解或失活。

• 尽量减少操作时间和温度，以避免不必要的酶反应或氧化还原反应。

• 尽量提高目标蛋白质的收率和纯度，以减少后续分离步骤的难度和成本。

离心是一种利用离心力将混合物中不同密度的成分分离的实验技术。可以用于从粗提物中去除大的物质，如细胞碎片，或者从上清液中分离出不同的细胞组分，如核，线粒体，溶酶体等。

原理是：当混合物在高速旋转的离心机中旋转时，较重的成分会受到较大的离心力，向离心机轴远离的方向移动，形成沉淀或沉积；而较轻的成分会受到较小的离心力，向离心机轴靠近的方向移动，形成上清液或悬浮液。

将含有目标蛋白质的混合物装入适当的离心管或瓶中，放入离心机中，并设定好所需的速度和时间。然后启动离心机，等待离心结束后，取出离心管或瓶，并小心地倒出上清液或悬浮液，留下沉淀或沉积。如果需要进一步分离不同的细胞组分，可以重复进行多次不同速度和时间的离心，这称为差速离心。

离心法的注意事项是：

选择合适的缓冲液和抑制剂，以保持目标蛋白质的稳定性和活性；

选择合适的速度和时间，以达到最佳的分离效果；

使用检测方法来鉴定和定量目标蛋白质，以避免不必要的损失或污染。

透析法是一种利用半透膜将蛋白质溶液中的溶剂或小分子与外部缓冲液进行交换的实验技术。可以用于改变蛋白质溶液中的 pH，盐度，温度等条件，以保持或改善目标蛋白质的稳定性和活性。

透析法的原理是：当蛋白质溶液放置在半透膜（如透析袋）内，而半透膜悬浮在较大体积的缓冲液中时，由于渗透压的作用，水和小分子（如离子，糖，氨基酸等）可以通过半透膜自由移动，而大分子（如蛋白质）则不能通过半透膜。这样，蛋白质溶液和缓冲液之间的水和小分子会不断地交换，直到达到平衡状态。

透析法的操作方法是：将含有目标蛋白质的溶液装入合适大小和孔径的透析袋中，封闭好口部，然后将透析袋浸入较大体积的缓冲液中，并轻轻搅拌。根据需要，可以定期更换缓冲液，以加快交换速度。透析结束后，取出透析袋，并小心地收集蛋白质溶液。

注意事项是：

选择合适的缓冲液和抑制剂，以保持目标蛋白质的稳定性和活性；

选择合适的半透膜和透析条件，以达到最佳的交换效果；

避免使用过高或过低的温度，以防止蛋白质变性或沉淀；

避免使用过强或过弱的机械搅拌，以防止蛋白质破坏或泄漏。

柱层析法是一种利用不同的树脂（固相）和缓冲液（流动相）将蛋白质混合物中的不同成分分离的实验技术。

根据蛋白质的不同特性进行分离，例如：

• 尺寸：利用树脂中的孔隙大小过滤不同大小的蛋白质，称为凝胶过滤或尺寸排除层析。

• 电荷：利用树脂上的正负电荷吸附或排斥不同电荷的蛋白质，称为离子交换层析。

• 亲和力：利用树脂上的特定配体或抗体与目标蛋白质的结合反应，称为亲和层析。

柱层析法的操作方法是：将含有目标蛋白质的溶液加载到装有适当树脂和缓冲液的玻璃圆筒（柱）中，然后通过改变缓冲液的流速，pH，盐度等条件，使不同成分以不同的速度通过柱，并在柱出口处收集不同的管（级分）。

注意事项是：

选择合适的树脂和缓冲液，以保持目标蛋白质的稳定性和活性；

选择合适的柱和条件，以达到最佳的分离效果；

使用检测方法来鉴定和定量目标蛋白质，以避免不必要的损失或污染。