高分文献｜从成纤维细胞生成自组织感觉神经节类器官和视网膜神经节细胞

类器官即定义为：

“器官特异性细胞的集合，这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out) 和空间限制性的系别分化而实现自我组建”。
类器官基于3D体外细胞培养系统，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态。
神经元即神经细胞，是神经系统最基本的结构和功能单位。神经节是周围神经系统（PNS）或中枢神经系统（CNS）中发现的一簇或者是一组神经细胞，他们之间经常相互连接，并且会与PNS和CNS中的其他结构相连，形成复杂的神经网络。感觉神经节（SGs）与视网膜神经节（RGCs）会受到各种疼痛、瘙痒、神经与退行性疾病的影响。有研究表明，转录因子（TF）可将体细胞重编程为感觉神经元，但并没有形成感觉神经节类器官（iSG）。
由于类器官在研究发育机制、建模与治疗相关疾病方面有偌大的优势，因此需要生成神经节类器官来作为研究神经发育、神经细胞建模、药物筛选和开发基于细胞治疗的体外工具。

（IF：13.6 期刊：SCIENCE ADVANCES 作者单位：中山大学眼科中心）

2020年中山大学眼科中心发表在SCIENCE ADVANCES期刊上的一篇文章《Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts》便证明自组织的iSG类器官可以通过Ascl1，Brn3b / 3a和Isl1（ABI）的TF组合从小鼠和人成纤维细胞中直接诱导，并且与内源性SG非常相似。通过ABI将体细胞重编程为iSG类器官的能力为建立神经疾病模型、研究其发病机制、筛选抗活性药物和开发细胞替代疗法提供了新的可能性，有助于实现疼痛的精准医学。在文献中观察iSG形成的动态过程使用了JuLI™ Stage活细胞成像分析系统。

使用JuLI™ Stage在明场下对经ABI慢病毒或Ascl1慢病毒感染后的MEFs细胞进行活细胞成像，实时监测慢病毒感染后细胞形态变化。由双因子或三因子组合（AB、AI和ABI）诱导的神经元簇通过厚厚的束状神经纤维相互连接，在形态上类似于SG神经丛（图G到图I），因此被认定为iSG类器官。

感染指定慢病毒（A，Ascl1；B，Brn3b；I，Isl1）并培养 14 天的 MEF 的形态变化。标尺, A至F为160 μm G至I为80 μm

使用JuLI™ Stage在GFP荧光通道下监测ABI诱导iSG形成的过程，延时记录50h。与MEF相比，重编程的单个神经元看起来更圆，带有神经突，显示出更高的对比度和更亮的GFP荧光。


ABI诱导的单个神经元自组织成iSG的过程（0-24h的代表性图片）。箭头、箭头和星号表示三个独立的iNs在不同时间点的位置。比例尺，62.5 μm

延时记录ABI诱导的单个神经元自组织成iSG的过程
用 ABI（Ascl1、Brn3b 和 Isl1）诱导 CAG-GFP 转基因小鼠胚胎 MEF 10 天，然后使用JuLI™ Stage延时成像50h。以下图片是同一区域的荧光和明场同步记录为视频后的截图。在几十个小时的时间里，首先通过迁移形成了较小的细胞簇，然后合并成越来越大的类似于SG的簇。


用 A（Ascl1）诱导 CAG-GFP 转基因小鼠胚胎 MEF 10 天，然后使用JuLI™ Stage延时成像50h。以下图片是同一区域的荧光和明场同步记录为视频后的截图。在几十个小时的时间里，Ascl1诱导的神经元中未观察到这种自组织现象。


在这篇文章中运用了JuLI™ Stage的明场以及GFP通道对神经节类器官进行了实时观测与延时成像，但JuLI™ Stage作为一个功能强大的活细胞成像分析系统，应用十分广泛，包括细胞增殖、细胞毒性、细胞凋亡、细胞迁移、细胞分化、细胞转染、细胞趋化性、轴突生长、3D细胞成像、血管生成、类器官、报告基因、细胞培养质控、干细胞功能分析、细胞蛋白定位等。

其功能有：

1. 可放置培养箱内实时监控细胞生长，无需反复从培养箱中拿出所需观察的细胞，可随时、连续观察细胞形态变化、生长状态和运动过程，对于难培养和难消化细胞，可实时监控传代过程细胞状况，对于差异贴壁法分离细胞可准确监控不同细胞贴壁时间，从而得到状态良好的细胞；
2. 可兼容各种品牌培养容器，适用于6-384孔板、培养皿、培养瓶及各种载玻片；
3. 可智能分析细胞量，对捕获到的细胞图像，可基于图像测量细胞融合度，制作细胞生长曲线；
4. 配备多通道荧光（GFP、RFP和DAPI）与明场，可同时进行多通道成像，可对荧光表达水平检测
5. 具有全自动X-Y-Z轴平台，自动移动至所需观察的X-Y轴位置，并可通过Z轴拼接选项获取高质量图像。
6. 可以多位置成像以及图像拼接，通过自动移动和对焦，对多孔板的每一个孔及设定点位进行精确的活细胞成像，利用图像拼接功能快速进行全孔扫描。