高分文献|从成纤维细胞生成自组织感觉神经节类器官和视网膜神经节细胞
使用JuLI™ Stage在明场下对经ABI慢病毒或Ascl1慢病毒感染后的MEFs细胞进行活细胞成像,实时监测慢病毒感染后细胞形态变化。
类器官即定义为:
“器官特异性细胞的集合,这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来,并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out) 和空间限制性的系别分化而实现自我组建”。
类器官基于3D体外细胞培养系统,能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态。
神经元即神经细胞,是神经系统最基本的结构和功能单位。神经节是周围神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS)中发现的一簇或者是一组神经细胞,他们之间经常相互连接,并且会与PNS和CNS中的其他结构相连,形成复杂的神经网络。感觉神经节(SGs)与视网膜神经节(RGCs)会受到各种疼痛、瘙痒、神经与退行性疾病的影响。有研究表明,转录因子(TF)可将体细胞重编程为感觉神经元,但并没有形成感觉神经节类器官(iSG)。
由于类器官在研究发育机制、建模与治疗相关疾病方面有偌大的优势,因此需要生成神经节类器官来作为研究神经发育、神经细胞建模、药物筛选和开发基于细胞治疗的体外工具。
(IF:13.6 期刊:SCIENCE ADVANCES 作者单位:中山大学眼科中心)
2020年中山大学眼科中心发表在SCIENCE ADVANCES期刊上的一篇文章《Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts》便证明自组织的iSG类器官可以通过Ascl1,Brn3b / 3a和Isl1(ABI)的TF组合从小鼠和人成纤维细胞中直接诱导,并且与内源性SG非常相似。通过ABI将体细胞重编程为iSG类器官的能力为建立神经疾病模型、研究其发病机制、筛选抗活性药物和开发细胞替代疗法提供了新的可能性,有助于实现疼痛的精准医学。在文献中观察iSG形成的动态过程使用了JuLI™ Stage活细胞成像分析系统。
使用JuLI™ Stage在明场下对经ABI慢病毒或Ascl1慢病毒感染后的MEFs细胞进行活细胞成像,实时监测慢病毒感染后细胞形态变化。由双因子或三因子组合(AB、AI和ABI)诱导的神经元簇通过厚厚的束状神经纤维相互连接,在形态上类似于SG神经丛(图G到图I),因此被认定为iSG类器官。
感染指定慢病毒(A,Ascl1;B,Brn3b;I,Isl1)并培养 14 天的 MEF 的形态变化。标尺, A至F为160 μm G至I为80 μm
使用JuLI™ Stage在GFP荧光通道下监测ABI诱导iSG形成的过程,延时记录50h。与MEF相比,重编程的单个神经元看起来更圆,带有神经突,显示出更高的对比度和更亮的GFP荧光。
ABI诱导的单个神经元自组织成iSG的过程(0-24h的代表性图片)。箭头、箭头和星号表示三个独立的iNs在不同时间点的位置。比例尺,62.5 μm
延时记录ABI诱导的单个神经元自组织成iSG的过程
用 ABI(Ascl1、Brn3b 和 Isl1)诱导 CAG-GFP 转基因小鼠胚胎 MEF 10 天,然后使用JuLI™ Stage延时成像50h。以下图片是同一区域的荧光和明场同步记录为视频后的截图。在几十个小时的时间里,首先通过迁移形成了较小的细胞簇,然后合并成越来越大的类似于SG的簇。
用 A(Ascl1)诱导 CAG-GFP 转基因小鼠胚胎 MEF 10 天,然后使用JuLI™ Stage延时成像50h。以下图片是同一区域的荧光和明场同步记录为视频后的截图。在几十个小时的时间里,Ascl1诱导的神经元中未观察到这种自组织现象。
在这篇文章中运用了JuLI™ Stage的明场以及GFP通道对神经节类器官进行了实时观测与延时成像,但JuLI™ Stage作为一个功能强大的活细胞成像分析系统,应用十分广泛,包括细胞增殖、细胞毒性、细胞凋亡、细胞迁移、细胞分化、细胞转染、细胞趋化性、轴突生长、3D细胞成像、血管生成、类器官、报告基因、细胞培养质控、干细胞功能分析、细胞蛋白定位等。
其功能有:
- 可放置培养箱内实时监控细胞生长,无需反复从培养箱中拿出所需观察的细胞,可随时、连续观察细胞形态变化、生长状态和运动过程,对于难培养和难消化细胞,可实时监控传代过程细胞状况,对于差异贴壁法分离细胞可准确监控不同细胞贴壁时间,从而得到状态良好的细胞;
- 可兼容各种品牌培养容器,适用于6-384孔板、培养皿、培养瓶及各种载玻片;
- 可智能分析细胞量,对捕获到的细胞图像,可基于图像测量细胞融合度,制作细胞生长曲线;
- 配备多通道荧光(GFP、RFP和DAPI)与明场,可同时进行多通道成像,可对荧光表达水平检测
- 具有全自动X-Y-Z轴平台,自动移动至所需观察的X-Y轴位置,并可通过Z轴拼接选项获取高质量图像。
- 可以多位置成像以及图像拼接,通过自动移动和对焦,对多孔板的每一个孔及设定点位进行精确的活细胞成像,利用图像拼接功能快速进行全孔扫描。
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