干货 | 胶体金标记宝典

盐破坏试验是一把“双刃剑”。在最适条件的筛选过程中，盐破坏试验必不可少。

通常抗体或者抗原在合适的pH以及浓度的情况下，会结合在胶体金的表面，形成相对较厚的表面水化层，在一定程度上保护胶体金不会被高盐离子破坏；若选择的pH以及浓度不合适，胶体金表面抗体或者抗原结合较少或者没有，则高盐会造成“死金”，我们认为标记失败。

然而，盐破坏试验并不能百分百确认胶体金标记的成功与否，在实际的试验过程中，有些抗体或者抗原已经结合在胶体金上了，但是盐破坏后，标记的溶液仍然变色发紫或者发黑。造成这种情况的主要原因是胶体金-蛋白质表面的相对水化层比较薄，在高盐离子浓度的环境中，不足以保护胶体金造成胶体金标记复合物而聚沉死金，针对这样的情况，建议大家改用粒径小一些的胶体金球，通过盐破坏试验初步确定标记条件，然后再在大粒径的胶体金球中套用该条件。

胶体金复溶液的常用配方应包含缓冲液、蛋白保护成分、流动封闭成分、表面活性剂成分以及防腐剂成分，若配方不合理，如糖含量过低即蛋白保护成分不足，会引起喷金即“死金”，或者烘干过程中过量失水“死金”的情况；PVP·K30等大分子物质的添加，会让金标复合物的分散性更好；微量的表面活性剂会让胶体金释放的更加完全等。

若是喷金工艺，可以复溶到高浓度，建议20~60OD，一旦复溶浓度较低，在保证灵敏度的情况下喷金量就会比较大，会引起喷金条带的扩散，不利于切割生产；

而对于铺金工艺，建议使用较低浓度复溶，以减少边缘效应和铺金不均匀的情况。

以2019-COV-SARAS 项目为例

1、最适PH的选择

1)  配制PH值分别为6.2、7.4以及8.0的0.01mol /L PB缓冲液各600μl；

2)  向缓冲液中加入60μg的抗体，震荡混匀，形成抗体-缓冲液体系A；

3)  向A中添加400μl 100OD的高浓度金，震荡混匀，反应30min~60min；

4)  进行盐沉试验：取25μl上述金标混合物，加入975μl纯化水中，震荡混匀，加入100μl 10%NaCl溶液，混匀后观察胶体金的颜色变化情况；

5)  颜色几乎保持不变的条件即为最适PH的缓冲液。

注：1、如果这三种缓冲体系标记的胶体金颜色均在盐沉后变紫，则需更换缓冲液及PH。如酸性的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液，碱性的硼酸-硼砂缓冲液，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液等，这些缓冲液浓度不能高于0.01mol/L，以防止高盐造成胶体金的不可逆聚沉；

2、更换缓冲液后或者极端PH条件下，盐破坏仍旧死金，建议更换更小粒径的胶体金。

2、最适标记量的选择

1) 在最适标记缓冲液及PH确定后，如0.01M PB7.4，各取600μl，编号1、2、3；

2)  向1、2、3、中分别添加40μg、60μg、80μg的待标记抗体，震荡混匀；

3)  各加入400μl 100OD 高浓度胶体金溶液，混匀；

4)  进行盐沉试验，具体操作如1-4）；

5)  颜色几乎保持不变的条件即为最适标记量。

注：如果这三种浓度下抗体标记后，盐沉仍旧“死金”，建议增加抗体浓度至100μg、120μg等。

3、封闭

1)  在最适PH以及最适标记量的情况下，反应30min~120min后进行封闭

2)  常用封闭剂为BSA、Casein等水溶液,封闭时长20min,封闭蛋白的终浓度一般保持在0.5%以上

注：若出现添加BSA立即死金的情况，则该BSA未进行脱盐处理，建议更换BSA厂家

4、 复溶

1)  喷金工艺建议复溶浓度为40OD，喷金量2~6μl/cm；

2)  铺金工艺建议稀释至8~10OD。