Western Blot的成功之道
Western Blot的成功之道
近些年来，蛋白质组学研究是生物领域比较热门和研究广泛的方向。而Western Blot实验是研究蛋白组学的基本实验操作。但是一个成功的Western Blot实验结果需要注意很多细节。
Western Blot即蛋白质免疫印迹实验，利用抗原抗体特异性结合来检测目的蛋白的表达量。蛋白质印迹法是由瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所（Friedrich Miescher Institute）的Harry Towbin在1979年提出的。在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。蛋白免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中的蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
下面详细介绍每一步的操作：
一、样品的制备
样本来源一般分为细胞和组织，常用的裂解液为RIPA（强）裂解液，需要加入适量的蛋白酶抑制剂。根据所收集的细胞沉淀多少或组织块大小，加入适量的裂解液。根据说明书，冰上裂解10min或30min，定时进行涡旋震荡。用BCA试剂盒进行蛋白定量，加入Loading Buffer于99℃的金属浴上煮样10min。
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加入的Loading Buffer目的
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主要成分 |
主要功能 |
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SDS |
使蛋白质变性并带上负电荷 |
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甘油 |
增加样品密度，使样品沉降 |
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溴酚蓝 |
离子型染料，可观察蛋白的迁移 |
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DTT |
减少二硫键的形成 |
二、凝胶电泳
* SDS凝胶配置原则：
先配置分离胶，再配置浓缩胶；
分子量越高，分离胶浓度越低；
根据上样量选择对应的玻璃板和梳子。
配胶成分表：
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分离胶15% |
分离胶12% |
分离胶10% |
分离胶8% |
浓缩胶5% |
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总体积 |
10ml |
10ml |
10ml |
10ml |
5ml |
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30%丙烯酰胺（29:1） |
5ml |
4ml |
3.3ml |
2.7ml |
0.83ml |
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4XSDS-PAGE浓缩胶 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1.25ml |
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4XSDS-PAGE分离胶 |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
2.5ml |
0 |
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10%过硫酸铵 |
40ul |
40ul |
40ul |
40ul |
30ul |
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TEMED |
4ul |
4ul |
4ul |
4ul |
3ul |
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ddH2O |
2.4ml |
3.4ml |
4.1ml |
4.7ml |
2.84ml |
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最佳分离范围 |
10-40KD |
12-60KD |
20-80KD |
30-90KD |
—— |
配胶注意事项：
（1）清洗玻璃板：可以先用海绵擦清洗玻璃板，在用去离子水润洗一次，可以放置于烘箱或通风厨中晾干。
（2）按照配胶表进行配置，充分混匀后在玻璃板中灌胶。
（3）加水或者醇类液封，速度要慢，防止将分离胶冲不匀或变形。
* 电泳
采用SDS-PAGE电泳，每孔上样量可为20-50ng。在适当空内加入marker。先用80V电压使样品进行充分浓缩，到达分离胶后调为120V，当溴酚蓝要跑出即可终止电泳，进行转膜。
* 转膜
一般分为PVDF膜和NC膜，PVDF膜价格较贵，结合能力较强；NC膜价格便宜，结合能力较PVDF膜差，不能重复使用。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20 kDa的蛋白选用0.45 um的膜，小于20 kDa的蛋白选用0.2 um的膜。PVDF膜在使用时需预处理，用甲醇激活15s，目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合（注意：不要有气泡！不要将胶放干！原理：电场力作用条件下，PAGE胶中的带负电荷的蛋白会发生定向迁移）。转膜过程会产热导致蛋白质降解，因此要使用冰袋散热。目前市面上的快速转膜液可以在常温下400mA转30min完成，方便快捷。
注意事项：
如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和滤纸选的对就不会短路。
转膜方法：湿转转膜后可以用丽春红对膜进行染色，检验转膜效率。
* 封闭
一般用5%的脱脂奶粉或者5%的BSA进行封闭。对于磷酸化或者生物素标记的抗体只能用5%的BSA。封闭是假为室温1-2h。目的是去除非特异性结合。
* 一抗孵育
封闭后用TBST润洗一次，然后根据蛋白的分子量大小进行裁膜，将对应的膜放入用一抗稀释液配好的抗体中（具体稀释比例要根据抗体说明书进行）。在4℃条件下置于摇床上孵育过夜。
* 洗膜
一抗孵育结束后，回收一抗，用TBST洗膜，每次7min，洗3次。
* 二抗孵育
洗膜结束后，加入配好的二抗（对应好一抗的种属来源），室温下置于摇床上1h，然后回收二抗，再次洗膜。
* 显影
将PVDF膜洗干净后，滴加ECL发光液，孵育1min左右，可进行显影。
Western Blot可能遇到的问题：
无显色信号问题的原因分析：
1．裂解产物中抗原含量不足；
a. 抗原无表达或表达量过少
b. 蛋白降解或上样量不足
c. 裂解产物制备失误
2．制胶浓度比例不合适；
3．转膜不完全；
4．一抗稀释浓度过大；
5．二抗与一抗不匹配；
6．显色系统灵敏度不足
非特意性杂带出现的原因分析：
1．封闭或清洗不彻底；
2．一抗浓度过高；
3．蛋白降解；
4．抗体与非特异性蛋白交叉反应；
5．蛋白间聚集作用，形成二聚体；
6．转移膜使用不当；
7．操作过程中转移膜干燥
有一些污点的原因分析：
1．转膜有气泡；
2．孵育不均匀；
3．脱脂奶粉没有充分溶解
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品牌 |
货号 |
中文名 |
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JSENB |
ES427039 |
无水乙醇 |
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JSENB |
JS0039 |
Tris 醋酸 |
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JSENB |
JS0332 |
无菌水 |
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JSENB |
JS0018 |
二羟乙基甘氨酸 |
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JSENB |
JS0030 |
甲叉双丙烯酰胺 |
|
JSENB |
JS0028 |
甘氨酸 |
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