荧光定量PCR实验步骤及注意事项

1、总RNA抽提（*头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）
   1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

   2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

   3）充分研磨直至无可见组织块。

   4）13000g离心10min取上清。

   5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

   6）4℃下13000g离心8min。

   7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

   8）-20℃放置15min。

   9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

   10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

   11）4℃下13000g离心5min。

   12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

   13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

   14）55℃孵育5min。

2、反转录（*头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）
   1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

   2）加入1μl oligo(dT)15。

   3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

   4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。

   5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用*抽吸混匀。

   6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR
   1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
     2× qPCR Mix 12.5μl
     7.5μM基因引物 2.0μl
     反转录产物 2.5μl
     ddH2O 8.0μl
   2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
     2×qPCR Mix 12.5μl
     7.5μM内参引物 2.0μl
     反转录产物 2.5μl
     ddH2O 8.0μl
   3）PCR扩增
     预变性 95℃，10min
     循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s
     溶解曲线 75℃→95℃，每20s升温1℃
4、结果处理
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)

K=A-B

表达倍数=2-K

注意事项

1、长度：15—30bp。

2、G十c含量：应在40%一60%之间。

3、碱基分布的随机性

4、引物自身：不要含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

8、设计RT-PCR的引物时，上下游引物要跨内含子，以消除基因组DNA的干扰。

9、引物设计好后再NCBI上进行序列比对，检查是否可能有错配产物扩增。

10、引物设计要注意种属。