RNA提取及检测

RNA提取及检测

核糖核酸（缩写为RNA，即Ribonucleic Acid），存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。通常在细胞进行转染后，需要进行RNA水平及蛋白水平的检测。

RNA的检测即RT-qPCR，包括三大步骤：RNA的提取与浓度测定、逆转录为cDNA、以及实时荧光定量PCR实验。通过RT-qPCR实验，可以分析目的基因的转录水平。

RNA提取是RT-qPCR实验成功的首要步骤，RNA的质量直接决定RT-qPCR的结果。在实验中我们需要注意由于RNA分子结构不稳定和周围环境中无处不在的RNase对RNA降解造成的威胁。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图1 RNA和DNA

RNA提取及浓度测定

• 样本

选择生长旺盛期的细胞，如果对细胞进行处理，一般选择处理后48h左右的细胞；如果是组织样本，也尽量选择新鲜、生长旺盛的组织样本。

• 样本的收集及保存

获取样本后，最好立即提取RNA。如果细胞不能及时处理则保存于Trizol裂解液中；如果遇到不能立即处理的组织样本，则需要将组织剪成小组织块，在液氮中速冻1h以上，之后保存于-80℃冰箱。

• RNA提取注意事项

避免环境中RNase的污染: 实验台面需要用75%的酒精擦拭干净，操作过程需要佩戴口罩、帽子和手套等; 需要准备RNase-free的耗材。

4.常见的RNA提取方法

i沉淀法

Trizol裂解液是总RNA提取的常用试剂, 内含苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，释放核酸，并抑制细胞释放的核酸酶。

1）组织中提取RNA: 第一步需要液氮研磨，将组织块放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织块变软，再次加入液氮研磨，反复三至四次后加入50-100mg/ml的Trizol，转入离心管中，室温放置10min，使其充分裂解。12000rpm，离心5min，弃掉沉淀。细胞中提取RNA：根据细胞量加入对应的Trizol，在摇床放置10-15min后，收集到离心管中。

2）按照200ul氯仿/ml Trizol加入离心管中，混匀后室温放置10min（切勿用涡旋振荡仪，防止基因组DNA断裂）。

3）4℃，12000rpm，离心15min。

4）将上层水相转移到新的离心管中，按照500ul异丙醇/ml Trizol加入离心管中，室温放置10min。

5）4℃，12000rpm，离心15min。

6）按照1ml 75%无水乙醇/ml Trizol，加入到离心管中，4℃，12000rpm，离心10min清洗一次RNA沉淀，室温放置5min左右晾干（RNA不可过于干燥，否则很难溶解）。

7）加入适量DEPC水溶解RNA，在Nanodrop上测定RNA浓度。

ii试剂盒法

主要是利用离心柱法提取RNA，具体可根据各试剂盒的说明书进行提取。主要利用高盐吸附、低盐洗脱的原理，在于操作简单，耗时短，RNA完整性好，但是有的试剂盒浓度、纯度略低于沉淀法。

逆转录PCR

不同RNA逆转为从cDNA的效率不同，因此选择合适的逆转录试剂盒很重要。逆转录试剂盒通常包括逆转录酶、dNTP、引物等。

i逆转录酶

目前市场上有两种不同的逆转录酶，一种来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNA酶活性，它最适温度是42 ℃，最适pH 8.3。但是高水平的RNA酶活性既抑制cDNA产生也限制其长度。

另一种来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV)的逆转录酶，是单肽链的，有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶活性，最适温度37 ℃，最适pH 7.6，较弱的RNA酶活性，可扩增2-3 kb的cDNA。

ii dNTP

四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度，对于有效合成cDNA是至关重要的。如果其中只有一种的浓度小于10-50 μM，cDNA的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-500 μM。

iii 引物

逆转录引物一般包含三种：oligo dT，Random Primer Mix和特异性引物。客户可以根据个人需求进行选择。Oligo-dT引物对于大多数应用是首选的，因为它确保所有cDNA拷贝终止于mRNA的3' 末端并可获得最高产量的全长cDNA。

逆转后的cDNA不需要用Nanodrop来检测浓度与纯度，因为逆转录后的产物是一个混合体系（含有cDNA、未完全逆转录的RNA、dNTP、残余的引物以及各种蛋白和盐离子等成分），会干扰cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在这个位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分别相当于50 ng/μL的双链DNA，37 ng/μL的单链DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。例如，就dNTP而言，即使cDNA浓度一样，但dNTP也会严重干扰其测定结果。

实时荧光定量PCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中的每一个循环中产物的变化，通过CT值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析的一项技术。

CT值：qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时对应的扩增循环数（cycle Threshold）。CT值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。

基线：在PCR反应的最初的几个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即为基线。

扩增曲线：粗略来判断扩增效率。

判断扩增曲线是否良好的几个指标：

• 曲线拐点清楚；

• 曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高；

• 标准的基线平直，无明显上扬趋势；

• 各扩增曲线平行性好。

 

 

 

 

 

 

                                  

图2  qPCR扩增曲线

Real-time qPCR 的种类:一类为探针类，包括TaqMan®探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。一类为非探针类，其中包括如 SYBR® Green I 或者特殊设计的引物(如 LUX®Primers) 通过荧光染料来指示产物的增加。

Taqman®探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个荧光报告基团 ，3’端标记一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是 FRET 反应; PCR 扩增时，Taq 酶的 5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离 ，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP）， 有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台 。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图3  TaqMan探针原理

SYBR® Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料，与双链 DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR®GreenI 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中，SYBR® Green 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图4  SYBR Green染料原理

熔解曲线

熔解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图5  qPCR熔解曲线

品牌	货号	中文名
JSENB	ES427039	无水乙醇
JSENB	JS0020	8-羟基喹啉
JSENB	JS0332	无菌水
JSENB	JS0083	EDTA 游离酸
JSENB	JS0030	甲叉双丙烯酰胺