琼脂糖凝胶电泳实验
| 实验方法原理 |
用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6——9之间，离子强度0.02——0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100 bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20 kb，利用脉冲电泳，可分离高达107 bp的DNA片段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。 |
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| 实验材料 |
DNA
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| 试剂、试剂盒 |
琼脂糖 TBE电泳缓冲液 电泳载样缓冲液 溴化乙锭(EB)溶液母液 DNAGreen
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| 仪器、耗材 |
水平式电泳装置 电泳仪 台式高速离心机 恒温水浴锅 微量移液枪 微波炉或电炉 紫外透射仪 照相支架 照相机及其附件
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| 实验步骤 |
一、试剂配制
1. 5×TBE缓冲液：450 mmol/L Tris-硼酸，10 mmol/L EDTA，pH值8.0。使用时将上述储存液稀释10倍至0.5×TBE缓冲液，可同时作为电泳及制胶用的缓冲液。
二、制胶
1. 根椐制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉（总液体量不宜超过锥瓶的50%容量）。
2. 在锥瓶的瓶口上盖上保鲜膜或牛皮纸，并在膜或纸上扎些小孔，然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。此操作重复数次，直至琼脂糖完全溶解。
3. 使溶液冷却至50℃-60℃左右，如需要可在此时加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5 μg/ml）或按照1 μL / 30 mL的比例加入DNAgreen染料，并充分混匀。
4. 将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在3~5 mm之间。制胶模如下图所示，小胶倒入25-30 mL左右琼脂糖溶液，大胶则60-70 mL左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。
5. 在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。
三、上样
1. 取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1 μl样品与5 μl 6×上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。
2. 上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40 μl 为上限，大孔200 μl 为上限，具体和制胶膜规格相关）。
3. 每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
四、电泳
1. 加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110 V，电流在40 mA以上。
2. 当条带移动到距凝胶前沿约2 cm时（约40 min），停止电泳。
3. 紫外下拍照并观察。
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| 注意事项 |
1. 5×TBE缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。工作用电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液，取5×TBE缓冲液贮存液稀释，现配现用。
2. 用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。
3. 琼脂糖粉在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。溶解琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。
4. 凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存，一般可保存2～5天。
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| 其他 |
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖浓度 最佳线形DNA分辨范围（bp） 0.50% 1 000～30 000 0.7% 800～12 000 1% 500～10 000 1.20% 400～7 000 1.50% 200～3 000 2% 50～2 000 2%～5% 20～1 000 |
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