一种用ITS1区测序鉴定独活药材的方法

一、 实验目的

鉴定6种独活药材的亲缘关系。

二、 实验材料

1. 对照独活DH-0、待测样本DH-1、DH-7、DH-10、DH-14、DH-18

4.  ITS1 区 引物（F:CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA/R:GCTACGTTCTTCATCGAT）

5. 超微量电子天平（DENVER INSTRUMENT,TP-213）、电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）、旋涡振荡器（越新仪器，XH-C）、台式离心机（eppendorf centrifuge 5415 D）、超微量分光光度计（Simgen Cat.No.sim100）、电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-6C型）、PCR仪（Techne FPROG5Y Progene Thermal）

三、 实验方法

（一）DNA提取

2. 研磨充分后加入800μl 65℃预热的Buffer PD，继续研磨1分钟，使组织完全裂解。

3. 转移800μl 裂解产物至2 ml 离心管中，将离心管置65℃水浴30分钟。水浴期间每隔5~10分钟翻转离心管数次以帮助DNA的释放。

4. 加入800μl Buffer EX，用力混合均匀，12000 rpm离心5分钟。

5. 小心吸取上清，转入一个新的1.5 ml 管中。

6. 在上清中加入等体积的Buffer GP，混合均匀。

7. 吸取一半体积步骤6中的混合液（约600μl）加入到核酸纯化柱中（核酸纯化 柱置于2ml离心管中），盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

8. 弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，将步骤6中剩 余的混合液全部加入到纯化柱中，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

9. 弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱 中加入500μl Buffer WA，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

10. 弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化 柱中加入600μl Buffer WB，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

11. 弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，盖上管盖， 13200 rpm 离心2分钟。

12. 弃 2ml 离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5ml 离心管中，在纯化柱 中加入 100μl 65℃预热的Buffer TE，盖上管盖，室温静置2分钟，12000 rpm 离心1分钟，即可得到DNA。

（二）PCR扩增

PCR扩增体系：

（三）测序

把扩增产物及引物送到测序公司进行测序。

四、 实验结果

1. 在超微量分光光度计上用Buffer TE调零，测量提取的DNA，结果如下：

2. 在1%的琼脂糖凝胶上加入5μl洗脱的DNA/扩增产物进行电泳，结果如下：

（1）DNA电泳图

1、2：对照组独活DH-0的DNA；

3、4：DH-1的DNA

5、6：DH-7的DNA

7、8：DH-10的DNA

9、10：DH-14的DNA

11、12：DH-18的DNA

M：DL2000 Ladder

（2）PCR产物电泳图

M：DL2000 Ladder

1、2：对照组独活DH-0的扩增产物

3、4：DH-1的扩增产物

5、6：DH-7的扩增产物

7、8：DH-10的扩增产物

9、10：DH-14的扩增产物

11、12：DH-18的扩增产物

3. 测序结果

测序结果通过MEGA5软件对测试样品及对照样品的核苷酸序列进行对比。

1：对照组独活DH-0的序列

2：DH-1的序列

3：DH-7的序列

4：DH-10的序列

5：DH-14的序列

6：DH-18的序列

五、 分析与讨论

1. 从浓度测量结果和DNA电泳图来看，不同样本或多或少都提到了DNA，一般来说DNA的提取量和完整度与样本的新鲜程度密切相关，比如样本DH-0、DH-10、DH-18可能是放置久了，DNA降解比较严重，提取到的DNA电泳后呈弥散状，浓度也较低；而样本DH-1和DH-14应该是比较新鲜的样本，提取到的基因组就比较完整，甚至还提取到了RNA，核酸总浓度很高。

2. 从PCR扩增图来看，各个样本扩出的条带和对照组长度一致。

3. 从测序结果来看，各个样本的扩增序列和对照组扩增序列完全一致（扩增序列为除去上、下游引物的中间序列）。

4. 综上所述，样本DH-1、DH-7、DH-10、DH-14、DH-18在 ITS1 区扩增出的片段均未产生变异，可推断出与DH-0的亲缘关系很近。

5. ITS1是18S rRNA基因与5.8S rRNA基因间的内转录1区，作为非编码区,承受的选择压力较小,相对变化可以比较大。也就是说如果物种要产生变异，一般都是从非编码区的序列开始变化----因为即使非编码区的序列产生了变异，对物种日常的生命活动也没啥影响。本次实验确定了这些样本的ITS1 区均未发生变异，大致已经可以确定药材没有产生变种了。当然如果不放心，还可以用同样的方法测试一下ITS2区的序列的差异作为进一步的补充。