食品物种源性检测之一——牛肉制品的动物源性检测

一、 实验目的

对牛肉制品进行动物源性检测，判断其所含成分。

二、 实验材料

1. 肥牛卷（杭州达泰食品有限公司）、动物组织DNA试剂盒(Simgen Cat.No.3101050)，牛源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7801050)，鸡源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7805050)，猪源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7804050)，鸭源性DNA荧光PCR检测试剂盒(Simgen Cat.No.7806050)，1.5 ml离心管若干，一次性手术刀。

2. 台式小量离心机（eppendorf Centrifuge 5415D）

旋涡振荡器(杭州米欧仪器有限公司XH-C)

电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）

超微量分光光度计（Simgen Cat.No.Sim-100）

超微量电子天平（福州华科电子仪器有限公司 TP-213）

电泳仪（北京六一仪器厂 DYY-6C型）

ABI PRISM®7500荧光PCR仪

三、 实验方法

（一）DNA提取方法

1. 用手术刀切取25 mg肥牛卷，再用刀尖将组织剁成匀浆状，转移组织到一个1.5 ml离心管中。

2. 加入20 μl蛋白酶K贮存液，再加入180 μl 56 ℃预热的Buffer AT，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来。

3. 56℃水浴30分钟，期间旋涡振荡数次帮助组织溶解。

4. 加入200 μl Buffer SL，旋涡振荡约15秒混匀。将离心管置于70 ℃水浴10分钟。

5. 加入200 μl无水乙醇，旋涡振荡约15秒混合均匀。

6. 吸取步骤5中的溶液加入到核酸纯化柱（纯化柱置于2 ml离心管中）中，盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

7. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入500 μl Buffer WA(已加入无水乙醇), 盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

8. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WB(已加入无水乙醇), 盖上管盖，12000 rpm离心30秒。

9. 弃2 ml离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2 ml离心管中，13200 rpm离心2分钟。

10. 弃2 ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的1.5 ml离心管中，在纯化柱中加入100 μl 56 ℃温育的Buffer TE，盖上管盖，室温静置1分钟，12000 rpm离心30秒得到DNA。

 （二）荧光PCR操作方法

1. 按照下表配置荧光PCR反应体系：

按5管的用量配置好PCR反应混合液，按每管35 μl的量将反应混合液分装到八联管中。

2. 取10 μl提取的DNA，加入90 μl的 ddH₂O混合均匀，将其稀释10倍作为DNA模板。

3. 依次在PCR反应混合液中平行加入4.2 μl的DNA模板、ddH₂O（阴性对照）、阳性对照（牛DNA、猪DNA、鸡DNA、鸭DNA），盖上管盖，简短离心，最后于ABI PRISM®7500荧光PCR仪中进行荧光定量PCR。实验参数如下：（95℃ 1 min;95℃ 10s；60℃ 30s）×40 cycles

四、 实验结果

在超微量分光光度计上用Buffer TE调零，测量洗脱下来的DNA，结果如下：

2.在1%的琼脂糖凝胶上，加入5 μl提取到的DNA，电泳20分钟，结果如下：

3.荧光PCR扩增结果如下：

五、 讨论与分析

1. 由超微量分光光度计测量结果可知，从肥牛卷中成功提取到了一定量的DNA，其中A260/280比值偏高，考虑到肥牛卷是加工产品，RNA还存在的可能性极低，推测是降解的DNA。结合电泳图可知，提取的DNA确实存在严重的拖尾情况，不过主条带清晰明显，不影响后续的PCR扩增。

2. 由荧光PCR检测结果可知，此款肥牛卷中除了检测到牛源性成分外，还检测到了猪源性成分、鸡源性成分和鸭源性成分。但是猪源性成分、鸡源性成分和鸭源性成分的CT值分别为：32.915，32.997、34.823，35.013、34.923，34.891，相比牛源性成分检测到的数字要大13-14个CT值，推算下来浓度差距达到将近一万倍，掺假从动机上分析可能性不成立。

3. 由于CT值接近35被称为临界阳性值（即只有几个DNA分子检测到的CT值），所以我们推测这些非牛源的DNA来源最大的可能性是肉类加工过程中的检疫、运输、包装等流程所掺入的，杭州达泰食品有限公司提供的肥牛卷没有掺假行为。