如何证明反转录第一链cDNA成功了？

这个问题出自XXX领导之口

那小编我着实需要好好捋捋

为此小编我整日抓耳挠腮

百思不得其解

按理来说，RNA的质量没问题（28s和18s rRNA是否清晰、明显，亮度比符合2:1），那么RT产生的cDNA一般是不会出现问题的。但是偏偏有那么些个博学多才、才高八斗的抖机灵们想要一探究竟！

作为2G冲浪选手，小编我也机灵了一回

听听学霸网友们的声音

一号学霸：

一般可以用电泳检测是否合成适当大小片段的带，这方法看cDNA大小没问题（自信）；如果想看碱基那当然还是测序或者使用探针检测，就是比较麻烦（一如既往的自信）。

二号学霸：

cDNA的质量不好判断，因为cDNA产物是smear，所以只能根据smear的分布范围大概估计cDNA的质量，分布范围越大越好。但是，电泳看到的smear因为还和加样量相关，所以即使没有看到分布很广的cDNA一链，也并不等于它不存在（淡定如斯）。

三号学霸：

用PCR检测合成的cDNA中管家基因的量，如果出现比较好条带，基本可以证实你的cDNA没有问题，我们实验室一直这样控制（众人）。

四号学霸：

如果不怕烦的话，可以在反转第一链时加入少量同位素标记的dNTP，然后看一下放射比活度或做个放射自显影（别出心裁）。

五号学霸：

首先看你用什么方法合成cDNA，如果随机引物合成，三号的建议可以考虑（因为管家基因片段多数较短）。如果是LD PCR，则这些内参可能无法检验结果的好坏（有条有理）。

六号学霸：

ds cDNA检测我倒是做过（LD PCR），理论上由总RNA起始的，哺乳动物应该1.2%浓度的琼脂糖凝胶于0.5~6kb（可达10kb以上）有明显的smear，且有一些明显的亮带（脑、脾、胸腺除外）（过来人代表）。

七号学霸

做内参照啊！如GAPDH,β-actin,β-MG等（言简意赅）。

.........（好多学霸，真好！）

这么多学霸出谋划策，你，懂了吗？

为了防止有人和小编一样可爱，英语、术语分不开，我先来解释一下：

Smear：弥散带

LD PCR：全称Long Ditance PCR即长片段PCR

ds cDNA：指依靠DNA聚合酶，与cDNA相互补的第二链cDNA

选择试剂盒：您做RT实验想得到什么样的产物呢？

产品推荐

不含RNase H（合成长度更长）

预混组分（简单高效快捷）

一步法（轻松得到双链cDNA）

 如何检测第一链cDNA合成成功？ 

cDNA电泳检测（大多数学霸推荐，简单快速，但需注意特殊情况）

       取约5ul反应产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外成像检测，呈现出大小在200-10Kb的拖带，其中重心区域小1-4Kb之间，这说明反转录完全，得到了高质量的cDNA（如果RNA丰度低，电泳也可能是无产物，但是这种情况不代表PCR会无结果）。

cDNA测序（受限较多，但结果精准）

       全长双链cDNA做分子克隆实验，然后通过测序结果精确判断。

a.  Oligo(dT)18和Random Primers按比列使用可解决poly(A) mRNA模板限制和长度限制的问题

b.  序列特异性引物可获得你想要得目的序列

探针检测（相对较麻烦，但结果较精准）

       qPCR或RT-qPCR步骤

管家基因/内参基因（引物类型限制，适用范围受限）

       以反转录产物为模板，扩增内参基因，扩增有结果，说明cDNA的质量基本可以保证，这个方法限制于随机引物扩增（因为管家基因片段多数较短）。

       而Oligo(dT)18与序列特异性引物扩增或我们做LD PCR（2kb、10kb等长片段）时，这些内参扩增的几率远大于全长或大片段cDNA的扩增，这时可能就无法通过内参来检验cDNA扩增结果的好坏。

同位素标记

       反转录中加入少部分同位素标记的dNTP

       放射比活度或放射自显影检测