ctDNA EM-seq 甲基化测序
cfDNA（Cell free DNA）是人体组织排放到血液、尿液或脑脊液等循环体系中的降解的DNA小片段，是一种新型的分子标记物。ctDNA（Circulating tumor DNA）特指来源于肿瘤细胞的cfDNA，是液体活检主流方向。
报道表明：ctDNA的 5mC 甲基化和 5hmC 羟甲基化不仅可以作为肿瘤分子标志物，还可用于追溯肿瘤细胞的组织来源。在医疗大趋势下，ctDNA甲基化检测既具有极高的科研价值，又具备推进医疗临床实践的巨大潜能，为实现肿瘤临床治疗的全病程管理提供强有力的支持。利用ctDNA甲基化测序，仅凭一管液体就可以进行肿瘤诊断、疗效评估、实时监控、个体化用药、预测复发等，是里程碑式的新型液体活检技术。
针对血液样品中的 ctDNA 进行优化，云序生物为您带来一种基于酶学方法的 DNA 甲基化测序技术 EM-seq（Enzymatic Methyl-seq）。该方法结合使用多种酶，在保证 5mC 和 5hmC 在 Illumina 测序中仍被识别为 C 的前提条件下，将未发生修饰的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），并在后续的扩增和测序过程中被识别为胸腺嘧啶（T）。EM-seq 有效弥补了全基因组重亚硫酸盐法测序（WGBS）需要极端反应条件的缺陷，可以广泛应用于包含 ctDNA 在内的微量脆弱 DNA 样品。同时，EM-seq 得到的测序结果与 WGBS 得到的转化序列相同，因此可以使用相同的数据分析流程。运用 EM-seq 技术，仅需低至 10 ng 的 DNA 样品便可进行单碱基精度的全基因组 5mC 修饰测序。

EM-seq 的优势相比于传统的WGBS 拥有多种优势：

1、DNA 测序文库质量高、所需 DNA 起始量小

相比于WGBS，EM-seq 对 DNA 的损伤小，因此可以用更少 DNA 样品、更少的 PCR 轮数扩增出高质量的测序文库。云序生物提供的 EM-seq 服务，所需的 DNA 起始量可低至10ng。 

 

2、DNA 文库的插入片段更长、更完整

相比于WGBS，EM-seq 处理后的 DNA 片段更完整，长度更长，避免产生测序缺口。

 

 

3、出色的 GC 覆盖均一性

无论 GC 程度高低，EM-seq 的覆盖度都有均匀且优良的表现；相比之下，WGBS 测序文库高估了 AT 区，却低估了 GC 区，造成“GC 覆盖度偏误”。

4、均一的双核苷酸分布

由于“GC 覆盖度偏误”的存在，在连续双核苷酸的检出效率方面，WGBS 对于不同的双核苷酸存在较严重的偏误，而 EM-seq 则能展示出均一的覆盖情况。

 

5、更强的匹配率和更低的重复率

相比于 WGBS，EM-seq 测序结果与参考基因组的匹配率更高，同时重复率更低。

 

6、用更少的测序检出更多的 CpG 岛

同等测序覆盖深度的情形下，EM-seq 所发现的 CpG 数目要远多于 WGBS，在这其中有很大比例的 CpG 位点是仅仅只能能用 EM-seq 法才能检测到的。

 

 

 

7、多次实验之间的一致性更高

EM-seq 文库在不同起始量之间的相关性都很高，表明 EM-seq 检出的数据具有很好的可重复性，且甲基化检测灵敏度不会随着起始量的减少而降低；相形之下，不同的 WGBS 文库之间的相关性就不够理想。

 

8、更精准地检测转录起始位点的甲基化数据

在低表达基因的转录起始位点附近，胞嘧啶一般会发生甲基化修饰，但由于 WGBS 法倾向于低估 GC 区域，因此难免遗漏一些转录起始位点附近的甲基化修饰；EM-seq 因为其出色的 GC 覆盖均一性，可以更精准地检测转录起始位点的甲基化数。据。 

 

样品要求
1）样品类型：肿瘤患者的血浆、血清或 cfDNA。
血浆和血清相比较而言，推荐使用血浆，以减少淋巴细胞来源的 cfDNA 干扰。
2）样品量：血浆>5mL；血清>10mL；cfDNA>10 ng。
3）血浆提取：
使用 EDTA 抗凝管收集全血，切勿冷冻保存，只能在 2-8℃ 冰箱短暂存放，并尽快进行低温离心获取血浆。
若不能进行低温离心，则需要使用添加专有稳定剂的 STRECK 无创管来保存全血，可在常温条件下离心。
为了最大程度消除残留的细胞，血浆需要进行二次离心：第一次在 4℃ 条件下以 1600g 离心 10 分钟；第二次在 4℃ 条件下以 16000g 离心 10 分钟。
4）样品保存：血浆、血清样品液氮速冻后 -80℃ 冰箱保存。样品保存期间避免反复冻融。
5）样品运输：封口膜封好样品，干冰运输。

云序生物服务优势
优势一：一站式服务。客户只需提供样本，云序生物为您完成从ctDNA提取，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。
优势二：超微量ctDNA 起始量要求。云序生物可以进行低至 10 ng 的 ctDNA 测序。
优势三：测序数据真实可靠。云序生物避免了传统 5mC 检测方法的 GC 覆盖度偏误，还拥有更完整的 DNA 读长，文库质量更加可靠。
优势四：严格质控流程：云序生物质控流程严格，层层把关，为客户提供高准确度的结果。
优势五：专业化生物信息分析：云序生物强大生物信息团队，满足客户个性化数据分析要求。