荧光标记菌株

一、原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

二、技术流程：

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。

（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。

（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。

（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。

（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。

（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

绿色荧光蛋白的发光原理

GFP的第65至67位的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）残基，可自发地形成一种荧光发色团。当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”，导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下，发色团可进一步发生氧化脱氢，最终成熟，形成可发射荧光的形式。具体过程为：在 O2存在下，GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，并最终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。

GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光，中度氧化剂如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

绿色荧光蛋白的发光特性

GFP吸收的光谱最大峰值为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm的副吸收峰（蓝光）；发射光谱最大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰（Shouder）。虽然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于该激发光对细胞的伤害更小，因此通常多使用该波段光源（多为488nm）。此外，GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐（FITC）很相似，两者通常共有一套滤光片。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素强，特别是在450～490nm蓝光波长下更稳定。类似的，GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白，比如萤火虫荧光素酶等。