假病毒包装

一、假病毒简介

慢病毒：慢病毒（Lentivirus，LV）是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体，属于逆转录病毒，区别一般的逆转录病毒载体，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，因此具有广阔的应用前景。

腺病毒：腺病毒(Adenovirus，ADV)是一种没有包膜的直径为70～90 nm的病毒颗粒，具有较强的细胞和组织感染能力，腺病毒载体能够携带大容量的基因片段，适用于短时间内高表达的相关实验，可以快速获得目的产物，效率高。

腺相关病毒:腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）,也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒（通常为腺病毒）参与复制。研究过程中采用的重组腺相关病毒载体(rAAV) 源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。

二、慢病毒的储存和稀释：

 1：储存条件：-80℃可保存12个月左右，如果超过12个月，则病毒滴度下降可能较多，最好再使用前重新做滴度测定。4℃一般可储存1-2周。注意：慢病毒使用时要注意避免反复冻融，如需要多次使用，请将病毒分装后储存在-80℃。

2：慢病毒稀释：在使用前，将慢病毒冰浴融化或4℃冰箱融化，融化后放置在冰盒上备用。用完全培养基或

PBS稀释。稀释后的病毒请立即使用，不建议再分装冻存。

3：泰斯拓生物提供的慢病毒滴度单位为TU/ml，即每毫升慢病毒液中含有具有生物活性的慢病毒颗粒数。“TU”为“Transducing-Units”的缩写，中文为转导单位，表示可以感染并进入到目标细胞群中的病毒基因组数。如：病毒滴度为1×108TU/ml，即每毫升病毒液中含有1×108个具有生物活性的病毒颗粒。

三、特殊细胞感染注意事项

1：悬浮细胞

悬浮细胞感染可以采用离心感染法，在培养皿中加入病毒后，可以将培养板子密封，然后使用水平转子1000g离心1h，再放回培养箱中培养，这样可以增加病毒与悬浮细胞的接触概率，从而提高感染效率。

2：极难感染的细胞

有些细胞很难感染，那么单次感染之后的效率很低的情况下，可以采用多次反复感染的方法来提高感染效率，即在进行一次感染之后，重新加入新鲜病毒再次感染，一般在加强感染之后，可以显著提高细胞的感染效率。但在两次感染之间，要注意调整好细胞状态，因为病毒在感染细胞之后是存在细胞毒性的，会影响细胞的生长状态。

3：原代细胞

对于原代细胞，一般细胞生长比较缓慢，且其传代能力较差，所以在接种的时候，可以提高细胞密度在50%以上。

4：非分裂细胞

对于一些非分裂细胞，其复苏或接种后细胞不再分裂增殖，所以在进行感染时，细胞的密度得在80%以上，所以在复苏或者接种时就得注意把细胞密度铺在80%以上。

最适MOI预实验

5：贴壁细胞

（1）：感染前一天，用胰酶消化目的细胞并计数，然后将细胞接种到96孔板，培养基体积为100µl，使得第二天进行病毒感染时的细胞汇合度20-30%左右。对于大部分细胞，我们通常认为培养24h后细胞数量是铺板数量的两倍。

（2）：MOI值的设置若有文献参考，可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值；若无文献参考可按照MOI 1，10，50，100设置MOI梯度进行摸索。

（3）：根据细胞数，按照MOI 1，10，50，100计算出需要加入的病毒滴度（最适MOI预实验一般选用荧光对照病毒），然后使用含有终浓度为8ug/ml左右的polybrene（Cat.TA003）的完全培养基在对应的EP管里进行稀释，总体积为100µl。吸掉各孔中上清液，更换为稀释好的不同MOI的病毒液，混匀，继续培养。感染后24h后用完全培养基进行换液，过程中观察细胞形态，发生变化时可以提前到8h换液，保持细胞正常生长。

（4）：感染后约72h，观察感染效率。根据后续实验内容，选择合适时间点进行实验。可按照实际感染情况，校正MOI。

（5）：最适MOI的选择原则：1）：细胞状态不受影响，2）：尽量用较少的病毒，3）：选择感染效率80%左右的感染条件作为最佳感染条件。

6：悬浮细胞

（1）：感染前一天，制备悬浮细胞悬液，细胞密度约为1*10^5个/ml将细胞接种到96孔板。

（2）：MOI值的设置若有文献参考，可以参考值为中心设置梯度覆盖参考值；若无文献参考可按照MOI 1，10，50，100设置MOI梯度进行摸索。

（3）：根据细胞数，按照MOI 1，10，50，100计算出需要加入的病毒滴度（最适MOI预实验一般选用荧光对照病毒），然后使用含有终浓度为16µg/ml左右的polybrene（Cat.TA003）的完全培养基在对应的EP管里进行稀释，总体积为100µl。然后将不同MOI的病毒稀释液加到对应的96孔中，混匀，继续培养。感染后24h后再加入100µl完全培养基，以保持细胞正常生长，过程中观察细胞形态。

（4）：感染后约72h，观察感染效率。根据后续实验内容，选择合适时间点进行实验。可按照实际感染情况，校正MOI。

（5）：最适MOI的选择原则：1）：细胞状态不受影响，2）：尽量用较少的病毒，3）：选择感染效率80%左右的感染条件作为最佳感染条件。