小肠、肝脏、皮肤、肾脏四个类器官的共培养

A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine， liver， skin and kidney equivalents

小肠、肝脏、皮肤、肾脏四个类器官的共培养

Abstract

药物在小肠的全身吸收和代谢、肝脏的代谢以及肾脏的排泄是决定治疗候选药物有效性和安全性的关键因素。然而，在大多数体外试验中缺乏这些应用物质的全身测试数据。在本研究中，我们以一分钟的时间建立了一个微生理系统，在共培养的28天内维持四个器官的功能的标准的微系统。预成型的人体肠道和皮肤模型已经被集成到标准细胞培养植入体的四器官芯片中，其尺寸比人体对应器官小10万倍。一个3d球体，相当于十个肝小叶，模拟肝功能。最后，由人近端小管上皮细胞单层覆盖的聚合物膜形成了一个屏障，将流经器官的介质与肾脏排出的液体隔开。蠕动片上微泵确保脉动介质流动通过微流控通道连接四个组织培养室。第二个微流控电路确保通过肾脏上皮细胞层排出的液体的引流。这个四器官芯片系统保证接近生理的液体与组织的比例。深入的代谢和基因分析显示，在共培养的2到4天内建立了可重复的稳态，持续至少28天，独立于个体人类细胞系或组织供体背景用于每个等同器官。最后，三维成像双光子显微镜可视化的细节空间分离的两个微流近端小管上皮。据我们所知，本研究是第一个建立体外微流控ADME分析系统，并对候选药物在28天内进行重复剂量全身毒性测试的方法。

Introduction

器官芯片微生理组织培养系统的成功，刺激研究人员通过所谓的“人体芯片”或“人芯片”系统，在体外挑战更系统化的人类生物学水平。这种系统的目标是在类人代谢环境中结合几种器官等效物，或针对类人体内的药代动力学和药效学。这些微系统中的第一个是Shuler和他的同事研制的微细胞培养模拟物（μCCA），它通过再循环介质支持单个肝脏、骨髓和肿瘤细胞系培养室之间的分子相互作用外置泵和外置公用储液器。生理流动速度和物质停留时间可以维持在一个高的液体与组织的比例。同样的培养基再循环的解决方案已经被Zhang和他的同事们用在了多通道3D微流控细胞培养系统（μFCCS）上，并结合了人的肝脏、肺、肾脏和脂肪细胞培养室。相比之下，Imura和他的同事所研发的最先进的微生物测定系统，将人的肠、肝和乳腺癌细胞系在一个单一的线性通道中进行单向流动而不需要介质再循环。这些多器官系统的优点是在通道中有明确的可调节的液体流量和可控制的局部组织液比。然而，由于小细胞数（大多低于10000个培养室）物质暴露时间在大多数现有微系统通常从24小时到72小时不等，很少超过7小时天。我们最近推出了一种多器官芯片（MOC）平台，实现两种不同人的3D共培养，例如肝球和皮肤穿刺活检，神经元球状体或肠道组织，处于稳态进行反复剂量物质测试一个集成片上微泵和互连微通道支持相关的脉动介质灌注这样的替代血液循环中的组织液比two-organ-chips。人类屏障器官的结合与肝脏模型等同，如皮肤、肠或肺允许生成关于物质吸收和在两个器官之间的分布及其代谢人类的肝脏组织。

这里我们的目标是扩展我们的MOC平台的功能代谢和排泄（ADME）沿时间轴分布重复剂量物质试验。因此，我们生产MOC格式能够承载四种相当于人体器官的器官:i）重建的人体3D小肠选择口腔和真皮物质吸收的皮肤活检，iii） 3D肝脏当量，使初级物质代谢iv）肾近端小管室支持代谢物的排泄。为这四种人体组织的共培养而建立的系统培养至少28天。在这里，我们证明了四种器官等效物的显著的稳态和功能试验期28 d。屏障的完整性、连续分子输运与梯度和四器官芯片的代谢活性可以被证明（4OC）共培养，从而使它成为一个完美的进一步进行体外ADME和重复剂量毒性试验的平台。

Material and Methods

Device design and fabrication

我们设计并制作了一种微流控MOC器件每一个都由一个单独的蠕动片上微泵操作肾近端小管培养重叠隔间。Fig. 1a简要说明了该系统。微泵软件控制方便顺时针和逆时针方向的流体流动。蠕动式片上微泵吴和他的同事对两个电路进行了修改，每个代表3个500 μm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜阀在一排。他们是连续通过施加压力和真空来驱动。的盖片这个4OC可容纳六个空气压力配件，四个镶嵌形成四个不同的培养隔间组织类型和两个额外的储液器排泄器官。代理血流回路包括培养基总体积为830 μl，同时分离肠腔中池具有容积容量250 μl，排泄电路容纳600 μl的介质。

图1微流控四器官芯片装置概览。a）设备的3D视图，包括两个聚碳酸酯盖板，pms -玻璃代表小肠（1）、肝脏（2）、皮肤（3）和肾脏（4）组织的四个组织培养室。每个组织的中心横截面所述沿互连微通道排列的培养室。b）使用μPIV评价4℃下的流体动力学。俯视图四器官芯片布局说明了代理血液回路中的三个测量点（A、B、C）和两个测量点（D、E）的位置排泄电路。c）平均容积流量与替代血流回路和排泄回路的泵送频率相对应。共培养实验分别在0.8 Hz和0.3 Hz进行，用垂线表示。误差条是标准误差的意思。

通过对进行轻微改性，制备了4OCs上小下大，各2毫米厚，包含通道、微泵、膜的各自布置以及文化隔间的开口。更大的这一层被永久地粘在玻璃显微镜载玻片上占地面积75 × 25毫米（Menzel, Braunschweig, Germany）通过低压等离子体氧化（Femto; Diener, Ebhausen, Germany），这样就形成了各自的流体密性标准通道高度为100 μm的微流体。后来，PET膜（1 μm pores; Polyester Track Etched (PETE) Membrane, GVS, Zola Predosa, Italy）有一个直径4毫米的胶粘在PDMS层上。连续，第二，更小的PDMS （21.6 × 33.6 mm）层永久通过低压等离子体氧化与第一层结合，形成与第二电路的连接，分离第一个和下一个电路由PET膜组成。代理血液循环包括三个培养室：肠道培养室能够容纳细胞培养物用直径9毫米的膜插入肠道组织；ii）肝球形培养室直接暴露于流体流动；iii）皮肤活检培养室，活检组织被保护的地方通过一个标准的Transwell小室insert（厚度10μm，孔径0.4 μm）。