为什么我的qPCR每次结果都不太一样？

为什么我的qPCR每次结果都不太一样？

qPCR是不是会做不好呢？即使是看了人家文献里的PCR方法，照搬了人家的引物，还是做得每次结果都不一样？

其实具体原因有这么几个。

第一点，你基本上不太会用移液枪。移液枪特别是微量移液枪，特别长期快速操作，也就是说弹簧没来得及恢复又进行下一步按压。极其容易导致……你的大拇指关节受损。好吧，这都是其次，关键是你的移液量可能都会有变化。

所以，关爱拇指，吸取液体时，保持1-2秒，给弹簧一个缓冲。当然，在加模板的时候，提高模板加样量，也可以尽可能减少每次加样的误差。

吸取液体的时候，需要把枪头插入凹液面底部，而不是插到凹液面的侧面。侧面比较容易产生气泡：

当然，你会说，每次枪头都插很深，但是这样的话，就很容易在枪头上沾上液滴，在微量的模板加样时，很容易导致加样量的误差。

当然，以上都是第一点。

第二点做不好的原因的RNA的降解，当然也就是RNA完整性的问题，RNA的完整性，一般体现在电泳过程中18S和28S的亮度上，如果这两个条带的RNA亮度变低，甚至没有，就说明RNA的完整性应该会有损失。（但实际上现在没人去跑电泳）导致RNA完整性受损的原因有很多，比如：

包括镁离子，pH，温度，紫外线，福尔马林等等都会对你的RNA产生影响。所以，要处处小心。于是有人做了这样的实验，就是对于RNA的降解，有没有什么方法可以降低RNA降解对于qPCR的影响。

他们分别分析了3`端和5`端的扩增CT值，以及长片段和短片段的ΔCT，发现RNA的完整性缺失与3`端和5`端没多大关系，但是短片段会比长片段扩增效率更高。所以，qPCR引物设计的过程中，尽量把片段设计得短一点。

第三点，也是相对来说比较难解决的，就是抑制物，在反转录过程中或者PCR过程中都可能有抑制物，这些抑制物，比如Na离子，EDTA，SDS，酚，血红素，腐植酸等等，都会对qPCR结果产生影响。具体体现在扩增曲线里会是这样：

实际上去除抑制剂也只能在抽提的过程中尽量洗脱掉抑制剂，别的操作过程中其实也没什么办法（加促进剂可能又会产生不稳定因素）。