OVCAR3 细胞专用培养基的冻存与处理及应用！

一、背景

OVCAR3 细胞源自一名60岁白人女性卵巢肿瘤组织，由T.C.Hamiltonyu建系于1982年。该细胞带有雌、雄激素受体。对阿霉素，顺氯氨铂，(左旋)苯丙氨酸氮芥有一定抗药性，适用于卵巢癌的抗药性研究。OVCAR-3染色体数量在亚三倍体范围内。

二、培养基及培养冻存条件准备

1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO，货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

三、细胞处理

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

四、应用

用于TAK1在卵巢恶性上皮肿瘤中的表达及其对紫杉醇在SKOV3和OVCAR3细胞中的化疗增敏研究：

对TAK1在卵巢癌组织和接受紫杉醇治疗复发卵巢癌组织中的表达情况进行检测,并通过RNAi技术和TAK1的特异抑制剂5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞系中的TAK1的表达,建立耐受醇的SKOV3PR细胞系,观察TAK1的表达情况及其对细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响;建立雌性裸鼠的移植瘤模型,观察抑制了TAK1后移植瘤对紫杉醇治疗的反应,探讨TAK1在卵巢癌中的预后价值及TAK1在卵巢癌发生发展过程中的作用,试图建立抑制TAK1在紫杉醇治疗卵巢癌中的潜在的抗肿瘤潜能,并期待这些实验室数据能够改变卵巢癌患者的临床治疗效果。

抑制TAK1的表达对卵巢癌SKOV3及OVCAR3及耐紫杉醇的SKOV3PR细胞的生物学行为的影响目的:通过si RNA和5Z-7-oxozeaenol抑制卵巢癌SKOV3细胞SKOV3PR细胞和OVCAR3细胞中的TAK1的表达,分析沉默了TAK1的表达对不同卵巢癌细胞的增殖、凋亡及侵袭能力的影响,观察TAK1沉默后紫杉醇对不同卵巢癌细胞的细胞毒作用。

方法：使用两个独立的TAK1靶向si RNAs（signal Silence（？）siRNAⅠ#6317和Ⅱ#6318）转染SKOV3和OVCAR3细胞,同时设立阴性对照组siRNAs（signal Silencecontrol si RNA#6201）,western blotting方法检测不同卵R巢癌细胞中TAK1、p-TAK1蛋白的表达。

使用CCK-8实验、Annexin V-FITC/PI双标记试验和流水细胞实验分析转染抑制TAK1后的肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性变化及经过紫杉醇处理和5Z-7-oxozeaenol处理后的增殖、凋亡以及侵袭能力的变化。

结果：沉默TAK1能够显著提高紫杉醇在SKOV3和OVCAR3细胞中的敏感性,5Z-7-oxozeaenol对于抑制TAK1的磷酸化抑制呈剂量依赖,5Z-7-oxozeaenol增加紫杉醇的细胞毒性的能力随着其浓度的增加而显著增加,在SKOV3细胞系中如无5Z-7-oxozeaenol处理,紫杉醇的IC50为2.5而在SKOV3PR中,如无5Z-7-oxozeaenol处理,则其IC50值为236。PI染色的SKOV3细胞使用流式细胞分析发现紫杉醇能够增加G2/M期细胞比例,而SKVO3RP细胞对此并无此种反应,而同时给予5Z-7-oxozeaenol处理后,此种现象会再现。

凋亡检测发现紫杉醇组引起的凋亡与对照组相比较细胞凋亡明显上升（p=0.02）而紫杉醇+TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol组和对照组、5Z-7-oxozeaenol组及单独使用紫杉醇组相比较差异有显著意义（p=0.001）。

结论：沉默TAK1的表达能够增强紫杉醇对卵巢癌细胞的细胞毒作用,5Z-7-oxozeaenol提高紫杉醇的细胞毒作用呈剂量依赖性,耐受紫杉醇的卵巢细胞对于联合使用了TAK1抑制5Z-7-oxozeaenol和紫杉醇更为敏感;联合使用紫杉醇和TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol能够诱导G2/M捕获并能促进细胞凋亡。