结核分枝杆菌的生物学性状与实验室诊断及防治原则！

结核分枝杆菌（M.tuberculosis），俗称结核杆菌（tubercle bacillus），是引起结核病的病原体。1882年由德国细菌学家郭霍（Robert Koch，1843-1910）发现并证明为人类结核病的病原菌，该菌可侵犯全身各器官，但以引起肺结核多见。结核病是一种古老的疾病，全球广泛分布，是细菌感染性疾病致死的首位原因。

一、菌株简介

结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli），是人类结核病的病原体。是专性需氧的一类细菌，抗酸染色阳性。无鞭毛，有菌毛，有微荚膜但不形成芽孢，其细菌壁既没有革兰阳性菌的磷壁酸，也没有革兰阴性菌的脂多糖。德国细菌学家郭霍（Robert Koch，1843-1910）于1882年发现并证明为人类结核病的病原菌。该菌感染人体导致的结核病是严重影响人类生命健康的一种传染病，经过与其几个世纪的抗争后逐渐得到控制，但近年来由于多种因素的影响，该疾病变得日趋严重。

二、研究历史

1882年，德国细菌学家郭霍（Robert Koch，1843-1910）首先发现并证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染多见。结核病严重影响人类健康和生命，人类与之斗争了许多世纪。在17-18世纪的欧洲，结核病被称为"白色瘟疫"，几乎100%的欧洲人被感染，25%的欧洲人死亡。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪90年代以来，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。结核病成为首要的再现传染病，成为了全球尤其是发展中国家最为严重的全球性卫生问题。全世界约有1/3的人感染结核分枝杆菌，每年有900万的新病出现，有200万人死于该疾病。

三、生物学性状

1、形态与染色

结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，大量分枝菌酸（mycolic acid）包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl- Neelsen）抗酸染色法，以5% 石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。本菌无芽孢、无鞭毛。

结核分枝杆菌在体内外经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，异烟肼影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，均可导致其变为L型细菌，呈颗粒状或丝状。异烟肼影响分枝菌酸的合成，可变为抗酸染色阴性。这种形态多形染色多变在肺内外结核感染标本中常能见到。临床结核性冷脓疡和痰标本中甚至还可见有非抗酸性革兰阳性颗粒，过去称为Much颗粒。该颗粒在体内或细胞培养中能返回为抗酸性杆菌，故亦为L型细菌。

2、培养特性

专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。结核菌在含氧40%~50%并有5%~10%CO2和温度为36℃±5℃，合适PH值为6.8~7.2的条件下生长旺盛。在一般培养基中每分裂1代需时18～24小时，营养丰富时只需5小时。  

初次分离需要营养丰富的培养基。常用的有罗氏（Lowenstein-Jensen）固体培养基，内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长，便于分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子，能刺激生长。根据接种菌多少，一般2～4周可见菌落生长。菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。在液体培养基中可能由于接触营养面大，细菌生长较为迅速。一般1～2周即可生长。临床标本检查液体培养比固体培养的阳性率高数倍。

3、生化反应

结核分枝杆菌不发酵糖类。与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性； 非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。热触酶试验检查方法是将浓的细菌悬液置68℃水浴加温20分钟，然后再加H2O2。观察是否产生气泡，有气泡者为阳性。

4、抵抗力

结核分枝杆菌对乙醇敏感，在70%乙醇中2分钟死亡。此外，菌体脂质可防止菌体水分丢失，故对干燥的抵抗力特别强。粘附在尘埃上保持传染性8～10d，在干燥痰内可存活6～8个月。结核分枝杆菌对湿热敏感，在液体中加热62～63℃ 15分钟或煮沸即被杀死。结核分枝杆菌对紫外线敏感。直接日光照射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。

结核分枝杆菌对酸（3% HCl或6% H2SO4）或碱（4% NaOH）有抵抗力，15分钟不受影响。可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的粘稠物质。结核分枝杆菌对1：13 000孔雀绿有抵抗力，加在培养基中可抑制杂菌生长。

5、变异性

结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗（BCG）就是Calmette和Guerin （1908）将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，现广泛用于预防接种。

四、致病性

结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。

致病物质

1、荚膜　荚膜的主要成分为多糖，部分脂质和蛋白质。其对结核分枝杆菌的作用有：①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3（CR3）结合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上的粘附与入侵；②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁殖所需的营养；③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易进入。故结核标本用4% NaOH消化时，一般细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还可抑制吞噬体与溶酶体的融合。

2、脂质　据实验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质成分有关，特别是糖脂更为重要。①索状因子 ：是分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂。能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关。它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌中提出，则细菌丧失毒力。②磷脂：能促使单核细胞增生，并使炎症灶中的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节。③硫酸脑苷脂（sulfatide）：可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活。④蜡质D：是一种肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟发型超敏反应。

3、蛋白质　结核分枝杆菌含有大量蛋白质，作为毒力因子与细菌致病性有关。结核菌素是菌体蛋白的主要成分，和蜡质D结合后能使机体发生超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症状，并在形成结核结节中发挥一定作用。

五、所致疾病

结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。结核分枝杆菌可通过飞沫微滴或含菌尘埃的吸入，故肺结核较为多见。

1、肺内感染  

⑴原发感染：多发生于儿童。多表现为低热，盗汗，少量咯血等症状。肺泡中有大量巨噬细胞，少数活的结核分枝杆菌进入肺泡即被巨噬细胞吞噬。由于该菌有大量脂质，可抵抗溶菌酶而继续繁殖，使巨噬细胞遭受破坏，释放出的大量菌在肺泡内引起炎症，称为原发灶。初次感染的机体因缺乏特异性免疫，结核分枝杆菌常经淋巴管到达肺门淋巴结，引起肺门淋巴结肿大和导致淋巴管炎，三者称为原发综合征。其中少数患者因免疫低下，可经血和淋巴系统，播散至骨、关节、肾、脑膜及其他部位引起相应的结核病。90% 以上的原发感染形成纤维化或钙化，不治而愈，但病灶内常仍有一定量的结核分枝杆菌长期潜伏。

⑵继发性感染：本类型是成人常见的类型。病灶亦以肺部为多见。多为原发潜伏病灶来源细菌导致，少数是外来源性细菌感染。主要表现为低热，盗汗，咯血等症状。长呈慢性发病，少数急性发作。由于免疫以及治疗的差别导致出现多种不同类型的病灶。继发性结核病病灶趋于极限，但是排菌较多，在流行病学上更为重要。

2、肺外感染　

部分患者结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内、外播散，如脑、肾结核，痰菌被嚥入消化道也可引起肠结核、结核性腹膜炎等。

六、免疫性

1、免疫机制

结核分枝杆菌是兼性胞内寄生菌，其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫，CD4T细胞是主要的免疫细胞。机体对结核分枝杆菌虽能产生抗体，但此抗体无保护作用。CD4T细胞激活后释放细胞因子刺激巨噬细胞，巨噬细胞杀伤和清除结核分枝杆菌，从而使病灶炎症消失，机体康复。病灶的清除与病灶的大小有关，病灶过大，形成纤维囊时，则巨噬细胞无法进入杀灭细菌，细菌会在病灶中进入静息状态，产生潜伏感染。

结核的免疫属于感染免疫（infection immunity），又称有菌免疫，即只有当结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其组分全部消失，免疫也随之不存在。

2、超敏反应

随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用的同时，也可以有迟发型超敏反应的产生，二者均为T细胞介导的结果。超敏反应既与免疫机制有关，也与细菌的致病机制有关。

七、实验室诊断

1、结核菌素试验

结核菌素试验（PPDtest）是应用结核菌素进行皮肤试验来测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应的一种试验。

常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，48～72h后红肿硬结超过5mm者为阳性，≥15mm为强阳性，对临床诊断有意义。若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介苗接种所致。

阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌，但应考虑以下情况：①感染初期，因结核分枝杆菌感染后需4周以上才能出现超敏反应；②老年人；③严重结核患者或正患有其他传染病，如麻疹导致的细胞免疫低下；④获得性细胞免疫低下，如艾滋病或肿瘤等用过免疫抑制剂者。为排除假阴性，国内有的单位加用无菌植物血凝素（PHA）针剂 ，0.1ml含10μg作皮试。若24h红肿大于PHA皮丘者为细胞免疫正常，若无反应或反应不超过PHA皮丘者为免疫低下。

2、结核菌γ干扰素释放试验

细胞免疫介导的结核菌γ干扰素释放试验（T-cell interferon gamma release assays，TIGRA，又称IFNGRA或GRA）是近年来采用酶联免疫吸附测定（ELISA）或酶联免疫斑点（ELISPOT）法定量检出受检者全血或外周血单个核细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的IFN-γ检测释放反应，用于结核菌潜伏感染的诊断。IFN-γ为Thl细胞分泌的一种细胞因子，不但能够反映机体结核的Thl细胞免疫情况，还与体内结核菌的抗原含量密切相关。被结核分枝杆菌抗原致敏的T细胞再遇到同类抗原时能产生高水平的IFN-γ，因此被用于结核潜伏感染的诊断。特异性强于PPD。

3、直接涂片镜检

标本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸阳性菌即可初步诊断。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。为加强染色，可用IK（intensified Kinyoun）法染色。将石炭酸复红染色过夜，用0.5% 盐酸乙醇脱色30s，则包括大多结核分枝杆菌L型也可着色。为提高镜检敏感性，也可用金胺染色，在荧光显微镜下结核分枝杆菌呈显金黄色荧光。

4、分离培养

将经中和集菌材料接种于固体培养基，器皿口加橡皮塞于37℃培养，每周观察1次。结核分枝杆菌生长缓慢，一般需2～4周长成肉眼可见的落菌。液体培养可将集菌材料滴加于含血清的培养液，则可于1～2周在管底见有颗粒生长。取沉淀物作涂片，能快速获得结果，并可进一步作生化、药敏等测定和区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。国内学者已证明结核分枝杆菌L型可存在于血细胞内或粘附于细胞表面。这种患者往往血沉加快，用低渗盐水溶血后立即接种高渗结核分枝杆菌L型培养基能提高培养阳性率。

5、动物试验

将集菌后的材料注射于豚鼠腹股沟皮下，3～4周后若局部淋巴结肿大，结核菌素试验阳转，即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变，并作形态、培养等检查。若6～8周仍不见发病，也应进行解剖检查。

6、快速诊断

一般涂片检查菌数需5x103～4/ml，培养需1x102/ml，标本中菌数少于此数时不易获得阳性结果，且培养需时较长。应用多聚酶链反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得阳性，且1-2d得出结果。操作中需注意实验器材的污染问题，以免出现假阳性。又细菌L型由于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞破裂后，则可出现阳性。有条件的单位使用BACTEC法，以含14C棕榈酸作碳源底物的7H12培养基，测量在细菌代谢过程中所产生的14C量推算出标本中是否有抗酸杆菌，5～7d就可出报告。

八、防治原则

1、预防

近20年国际组织提出控制结核病主要方法有：发现和治疗痰菌阳性者在传染源上进行防控。卡介苗（BCG）接种。目前较普遍的看法是接种后尚不足以预防感染，但可以显著降低新生儿发病及严重性。Dots战略是who根据20年来的经验将其上升为一种保证结核病控制对策获得成功的战略。

2、治疗

目前结核病治疗主要以药物化疗为主。利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素，吡嗪酰胺等为一线抗结核药物。药物失败或者危及生命的局限性病变等可以采取手术治疗。治疗中重要的还有对症治疗，例如发热的治疗，咯血的防治等。