小普课堂 ▏做好抗体标记，这4种方法你都用对了吗？

抗体标记是指将标记物（酶，荧光素，生物素等）共价连接到抗体上，与待检测物（如某些特定抗原）特异性反应形成多元复合物，并借助于仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定，以用于对抗原、抗体反应进行定性和定位研究或进行定性和定量测定。

荧光色素标记抗体

这种标记方法是将荧光素与相应的抗体(或抗原)结合，将荧光标记的抗体(或抗原)与标本中相应的抗原形成荧光标记的抗体-抗原复合物，用荧光显微镜观察。在显微镜若存在荧光则意味着存在抗原抗体复合物，因此可根据已知的抗体(或抗原)推断出另一种未知抗原(或抗体)的存在。

用于分离标记抗体和游离的荧光色素准备好凝胶滤柱。使用消除分离球形蛋白的极限 20 000 ～ 50 000 凝胶介质和细粒凝胶(直径约 50 um）。所需凝胶滤柱的尺寸可根据偶联反应的总体积进行× 20 来确定。按厂家说明准备滤柱，用 20 双柱床体积 PBS 注入滤柱，直到缓冲液水平刚刚降低到柱床顶部，关闭滤纸底部的阀门或使用塑料粘土(或 parafilm ）封闭底部，使滤柱不再流动。

用0.1mol/L 硼酸钠或碳酸钠的制备浓度至少为 2mg/ml 的抗体溶液（pH9.0）。含一级胺的外来分子应避免引入。

用无水DMSO 溶解(优级纯) FITC或TRITC至1mg/ml。每次标记反应时需即时配置。

每 1ml 蛋白溶液加50ul染液，每次都要5ul 慢慢加入，加入时应轻轻连续搅拌。

置4℃避光反应1h 。

加氯化铵至50mmol/L，室温孵育2h。加入0.1 %二甲苯氰和5％甘油。

通过凝胶过滤分离结合物与未结合的染料。小心地将偶联反应产物加在滤柱顶部，打开阀门使抗体溶液流过滤柱直至刚好进入柱床。再小心地将 PBS 加在滤柱顶部并与缓冲液供应装置连接。结合染料的抗体首先洗脱，通常可在室光下见到。

将洗脱液的结合物4℃贮存于避光容器，必要时加入 0.02％叠氮钠。

进行荧光素偶联反应时，应通过测量495nm和280nm 波长的吸光值计算荧光素和蛋白的比率，罗丹明的测量波长在 550nm 和 280nm 。荧光素的吸光值比例（ 496nm/280nm ）应在 0.3 ～ 1.0 之间，罗丹明的吸光值比率（ 550nm/280nm ）在 0.3 ～ 0.7 之间。低于上述比率将导致低信号，高比率则出现高背景。若比率太低，应使用低浓度抗体与高浓度染料重复结合；若比率太高，则可适当调整后重新标记，或通过 DEAE 离子交换层析柱进一步纯化抗体。用 10mmol/L 磷酸钾（ pH8.0 ）平衡并灌注滤柱，通过增加盐浓度进行梯度洗脱。测量每一组分的吸光值比率（ 495/280 或 550/280 ），选取适当组分合并。

生物素标记抗体

抗体标记中生物素的引入使整个过程灵敏度大大提高！这种方法可使抗体或其它蛋白质的ε-氨基与酰化的生物素共价结合，生物素化的分子可以通过酶标记的抗生物素蛋白或荧光染料-链霉抗生物素蛋白复合物来检测。小分子水溶性生物素对链霉亲和素的高亲和力是该方法的设计基础。

用无水 DMSO 配制 10mg/ml 生物素 N- 羟基琥珀酰亚胺酯溶液。

硼酸盐缓冲液（0.1mol/L, pH8.8 ）配制浓度至少为1 ～3mg/ml 如果在抗体储存过程中添加叠氮钠，则必须在硼酸盐缓冲液中充分透析去除叠氮钠。

按25～100μg/mg将生物素酯加入抗体，在室温下均匀混合孵化4h。在完成组合反应之前DMSO最终浓度不得低于5 %，否则生物素酯会沉淀。高浓度的生物素酯会导致体上结合多个生物素分子，因此所有抗体都可能被标记。较低的比例将使生物素化保持在最低限度（25μg生物素酯/mg摩尔比最初是抗体10:1）。

每250μg添加生物素酯20μl1mol/L氯化铵，室温孵化10min 。

使用抗体溶液PBS 或其他缓冲液透析，以去除未结合的生物素。由于生物素分子较大，透析比预期的要慢，或使用蛋白质A或蛋白G层析柱再次纯化抗体。

标记抗体按纯化抗体的储存方法保存。

放射性碘标记抗体

蛋白质的碘标记方法有很多种，比如我们常用的化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化等。

在碘标记前，准备氯甘脲包试管（2支6mm碱性玻璃管或1.5ml锥形试管)。氯甘脲溶于浓度0.5μg/ml的氯仿中。然后将其分别加入试管管100μl和20μl。让氯仿在通风柜中挥发过夜。在干燥器中储存室温试管，可保存数年。包被有20μl氯甘脲试管碘化效率低。如果抗体在正常碘化反应中受损，可以使用。

准备分离标记抗体的凝胶层分析柱，体的凝胶层分析柱。排阻限制为20000～50000凝胶介质用于分离球形蛋白分子。选择中等粒度的凝胶微柱(直径约100μm）。按说明书准备装备1ml标记后，体积凝胶微柱的滤柱将被丢弃，因此应选择合适的滤柱。为了最大限度地减少碘化蛋白的非特异性组合，滤纸应至少先使用10倍体积的含0.02％叠氮钠的1％BSA/PBS然后再用10倍体积的PBS去除淋洗滤柱BSA。或者用含BSA使用前冲洗缓冲液膨胀凝胶颗粒BSA。让滤柱内的缓冲液流出，直到刚好低于柱床顶部，关闭凝胶柱底部的阀门，或用塑料粘土堵塞胶柱末端。

碘化反应前应立即准备终止管，用于终止氧化反应，保留未参与结合反应的剩余碘。1.5ml加入锥形试管50μl氯甘脲终止缓冲液

室温下，在通风柜内加入氯甘脲袋50μl抗体0.5mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5）配制，浓度为0.2～1mg/ml。

添加抗体氯甘脲试管500μCiNa，把吸液头扔进去放弃125I容器中的材料2min，时间可以稍微延长，但可能会增加抗体的氧化损伤。

用巴斯德移液管移动试管中的液体50μl轻轻混合氯甘脲终止缓冲液的试管。将巴斯德移液管和氯甘脲包放入放射性废物容器中。

小心将终止管中的反应混合物添加到滤柱中，并将移液管丢入放射性废物容器中。

放开滤柱阀门，开始收集洗脱液1.5ml锥形试管。碘标记蛋白流入凝胶微珠后，小心添加到滤柱中0.3ml含0.02％叠氮钠PBS。在第一管中继续收集洗脱液。当缓冲液到达凝胶微珠顶部时，用第二个锥形试管替换，然后加入滤柱0.3ml含0.02％叠氮钠的PBS，再收集洗脱液。继续重复上述洗脱步骤。微型检测仪用于监测各种管道125I标记抗体和游离标记物的峰值。抗体应出现在第一位2～4洗脱成分明显早于蓝色二甲苯蓝氰醇，后者与游离标记物一起洗脱。

合并含碘化抗体的洗脱组分。将未参与反应的标记物和整个过滤柱与放射性废物容器一起丢失。

可储存标记抗体1％PBS/BSA放入洗脱缓冲液中4℃保存。抗体虽然稳定，但放射性碘不稳定。因此，应标记抗体6周内使用。

生物合成法标记单克隆抗体

杂交瘤细胞在标记时必须生长旺盛，快速增殖。离心（3000 转/10min）收集大约2×106个细胞。

用37℃不含蛋氨酸的培养基重悬细胞，洗一次，然后离心300g，10min。

不含蛋氨酸的培养基重悬细胞至约106/ml。加入[35S]蛋氨酸(每次标记100μCi）可获得的放射性强度约为105～106cpm的抗体。

于CO2培养箱中37℃孵育过夜。

悬液细胞1000g离心10min，获得密集的细胞沉淀。放弃上清液。1/20体积的1mol/LTris(pH8.0)和叠氮钠至0.02％。