小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)培养经验

巨噬细胞属免疫细胞，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象，RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞）就是科学实验中常用到的细胞系，其来源为雄性Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。RAW264.7培养有许多注意事项，在培养过程中容易出现细胞形态改变（长出伪足）、消化困难、生长缓慢等问题。由于细胞的生长状态对实验数据是存在较大影响的，所以今天就来和大家分享一下RAW264.7细胞培养的经验。

RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，小而透亮。因为其具有较强的吞噬能力，并在吞噬抗原后释放趋化因子，促使细胞分化出伪足，粘附攀爬能力也因此增强。若细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣就会促使细胞呈现出梭形、长梭形，镜下观察就会发现细胞形态变为梭形且面积变大，不再是具有细长伪足的类圆形小细胞。这也是出现消化困难的一个主要原因。

1. 由于RAW264.7细胞易有不同形态，传代时就会发现形态变为梭形的细胞很难消化下来，轻敲培养皿细胞不会脱落，用力吹打又容易对细胞产生较大损伤，因此要尽量避免细胞发生形态改变。即在接种细胞时保持一个适中的传代密度，避免其向终末细胞分化，因为一旦细胞发生分化变为长形是无法恢复的，这是培养RAW264.7细胞时最需要注意的问题。

2. RAW264.7细胞喜欢连片生长，正常状态下应该是一小片一小片的分布在培养皿中，片片之间不相连接，等到长到更多更密的时才会连成大片，但同时也会叠加成层，容易出现部分细胞飘起无法贴壁的问题。所以，要关注好细胞的汇合程度，控制好细胞的生长速度，不能等到叠加成层时才去传代。

3. RAW264.7细胞传代后贴壁时间较短，半小时左右绝大部分细胞就能够贴下去，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察如小珍珠状一个个地散落于培养皿中。生长一段时间后，部分细胞会变成类似四角形，伸出伪足之类的。这个时候就是在提醒你注意传代了，此时无论汇合度如何都需要进行传代了，因为形态发生改变的细胞对实验结果会产生较大影响，最终造成实验数据不理想。

三、复苏、培养、传代和冻存

复苏：从液氮罐中取出细胞转移至-80℃冰箱平衡温度，准备15mL离心管根据需求加入适量预热过的完全培养基（细胞冻存悬液：完全培养基=1:6），37℃水浴锅孵育，复温后吸出细胞悬液至15ml离心管，离心去除冻存上清后，根据细胞量用新鲜培液重悬，转移至合适大小的培养皿中培养，第二天换液。

培养：DMEM-HD+ 10% FBS；5% CO² ，37.0°C

传代：去除培养皿中的旧培养基，滴加1×PBS清洗一遍，去除PBS，加胰酶消化，随时观察消化程度，加入完全培养基终止消化（胰酶：完全培养基=1:2），收集细胞悬液离心（一般为1100转,4分钟），去除上清，根据需求确定传代比例（约1:3～1：6传代/3d），用新鲜培养基轻柔吹打重悬，铺回皿中晃匀。

冻存：无血清冻存液，直接放至在-80℃冰箱，注意受冷要均匀，第二天转入液氮。

在培养RAW264.7细胞的过程中容易遇到的问题主要包括以下几种：

1. 复苏后存活率不高

2. 细胞形态发生变异

3. 不同形态细胞消化时间不等

4. 细胞生长速度缓慢

当你遇到类似问题时，可尝试以下几种解决方案。

1.复苏后存活率不高

  原因： RAW264.7细胞不同生长密度下细胞形态不同，若复苏密度太高，细胞增殖过快，会加剧细胞的营养缺失，加速细胞老化；若复苏密度太低，细胞生长缓慢。

  解决办法： 直径10cm的培养皿复苏细胞，细胞数量控制在1.0×10₆~1.5×10₆个

2.细胞形态发生变异

  原因： RAW264.7细胞的培养环境恶劣或吞噬过多抗原后会促使该细胞呈现梭形、长梭形，形态发生变化。

  解决办法： 改善细胞培养环境，例如与细胞接触的器皿保证无菌，使用质量较高的胎牛血清。

3.不同形态细胞消化时间不等

  原因： 细胞老化后，形态发生变化，细胞伪足变得多且长，这使得这种形态的细胞变得较难消化，使用胰酶长时间消化又会对细胞产生较大损伤。

  解决办法： 可在正常时间终止消化，收集大部分正常状态的细胞，再加入新的胰酶继续消化，而伪足过多过长的细胞，即使加胰酶消化10min及以上也是难以消化下来的，勉强消化下来，对后续的实验数据也会产生较大影响，即没必要每次传代都收集全部细胞，已经发生分化的细胞无需保留要及时丢弃。

4.细胞生长速度缓慢

  原因： 传代时汇合度过低会导致细胞生长缓慢，甚至难以贴壁，或是细胞发生了支原体污染。

  解决办法： 定期传代，控制好传代比例，汇合度不可过低。及时进行支原体检测，如发现污染，即刻使用支原体去除试剂进行清除。