靶向肿瘤液体活检中DNA低丰度突变，新技术有效提高MRD检测准确性！
背 景 介 绍
生物的遗传多样性和DNA突变在疾病中有着关键作用。越来越多的研究表明检测多种不同的低丰度突变是非常必要的。然而，DNA测序的覆盖度和深度影响着突变检测的准确性。要想准确检测低丰度DNA突变，则需要较高的测序深度，但这种测序方式会严重限制其覆盖度。这就解释了为什么在测序成本大幅降低的今天，对大量不同的低丰度突变进行检测仍然非常昂贵。当鉴定低丰度突变时，每个基因位点需要超过100X的reads覆盖，虽然已有的部分方法可利用更少的reads以节省成本，但付出的代价则是大大降低了检测的特异性，不利于后续的应用。
液体活检是一种日趋风靡的技术。尤其是基于血液的液体活检技术可以精确、低成本地跟踪癌症患者体液中不同的细胞游离DNA (cfDNA)，寻找特有的肿瘤突变，从而增强临床决策能力。例如，应用液体活检检测癌症治疗后的微小残留病 (MRD) ，则有可能提示辅助治疗后是否需要手术，术后是否需要辅助治疗，以及最终停止治疗是否安全等。但血液中的肿瘤DNA比较稀少，并非所有突变都可能出现在单个采血管中。
近日，Broad研究所等机构的研究团队联合提出一种科学假设：去除样本中正常 (即非肿瘤来源的) cfDNA可能会更精确、更低成本地检测患者肿瘤基因组中的数千个突变，并改善MRD检测。为此，他们开发了一种名为MAESTRO (minor allele enriched sequencing through recognition oligonucleotides，通过识别寡核苷酸进行次等位基因富集测序方法) 的测序方法，该方法结合了大规模突变富集和传统双端测序技术，使准确、低成本的突变检测成为可能。随后，研究团队将MAESTRO方法与传统的双端测序进行了比较，分析了该方法的测序性能，相关研究结果发表在BioRxiv上。
文章发表在BioRxiv
主 要 内 容
MAESTRO基本原理及流程
据文章介绍，MAESTRO是一种用来追踪临床标本中大量低丰度突变的准确且高效的基因富集测序技术。与传统的混合捕获双端测序不同，MAESTRO使用短探针来富集癌症患者特异性突变的等位基因。目前，该团队构建了可检测多达10,000个突变的短MAESTRO探针，这些探针被用来富集测序文库DNA分子，这些分子两端携带独特的条形码，用以识别突变。在对原发肿瘤进行测序以确定患者的特定突变后，挑选探针库中的特定突变探针进行建库，然后进行测序。研究团队表示，整个定制化测序过程大约需要3~4个星期完成，临床医生可以使用该方法监测MRD。
在后续的研究中，研究人员评估了MAESTRO的性能。结果表明，MAESTRO不仅可以鉴定出从癌症全外显子组测序中发现的低丰度突变，也可以在癌症患者cfDNA中检测数千种特异性突变，或将显著提高MRD的检测效率。
图1. MAESTRO能够在临床标本中精确、低成本地追踪突变，图片来源：BioRxiv
MAESTRO性能评估及验证
随后，该团队检验了MAESTRO检测低丰度突变和追踪基因组中数千种特异性突变的能力。在对16例拥有正常DNA匹配样本的肿瘤切片进行全外显子组测序 (WES) 后，即在拥有阳性对照的情况下，研究人员通过一个含有40个突变的检测组比较了MAESTRO和常规双端测序的性能。结果显示，对于大于0.1的变异等位基因频率（VAF），MAESTRO的突变检测准确率为0.75（范围：0.21-0.9），常规双端测序为0.98（范围：0.4-1.0）；对于小于0.1的VAF，MAESTRO的突变检测准确率为0.29（范围：0.07-0.82），常规双端测序为0.35（范围：0.04-1.0）。总体来说，两种方法识别突变的效果相似。
图2. MAESTRO突变检测性能的验证，图片来源：BioRxiv
随后，研究团队比较了MAESTRO追踪超罕见突变的能力。为此，研究人员使用1/100k稀释样本和阴性对照，结果表明对于常规双端测序在稀释样本中识别的突变，MAESTRO能够检测其中的81%，此外，MAESTRO 还检测到了稀释样本中额外的52个突变。不仅如此，在达到相同的突变检测水平时，MAESTRO所需测序的总reads数要比常规测序低100倍之多。
图3. MAESTRO突变检测时需要更低的测序深度，图片来源：BioRxiv
最后，该团队利用16名参加临床试验的乳腺癌患者的血液样本，分析通过追踪全基因组肿瘤突变是否能提高cfDNA的MRD检测。如图4A所示，与传统的测序相比，使用MAESTRO能够在每个患者cfDNA中准确检测到更多的肿瘤突变。
文章通讯作者之一，Gerstner癌症诊断中心副主任Viktor Adalsteinsson表示：“在对术前乳腺癌患者的分析中，当追踪全基因组突变时，可以检测到血液中更多的肿瘤突变，有助于排除不确定性克隆性造血突变，并为MRD检测提供独特的优势。”
图4. MAESTRO改善了术前MRD的检测，图片来源：BioRxiv
小 结
据了解，MAESTRO是目前第一个能够同时富集和检测数以千计的全基因组突变的高精度测序方法，该研究也是第一个从液体活检中追踪数千个全基因组肿瘤突变的研究，通过足够的覆盖度和深度来优化MRD检测。目前，研究团队已经为MAESTRO申请了基于MRD的检测专利，并希望与合作伙伴进一步开发用于其他癌症类型和应用的集成平台。
Viktor Adalsteinsson表示:“通常人们需要对大量的DNA分子进行测序，才能找到那些来自同一DNA分子的突变，现在利用这项新测序方法，我们认为可以大大提高突变的检测效率，并且这可能不仅仅适用于基于液体活检的检测，也适用于其他类型的基于测序的检测。”
美国犹他大学Huntsman癌症研究所肿瘤学教授曼Manish Kohli称赞该技术是一项革新的技术。同时，Kohli指出：“研究人员只分析了一小部分乳腺癌患者的样本，而不是测试大量的患者和各种不同类型的癌症。在使用MAESTRO时，肿瘤类型可能很重要，因为其他类型的癌症不会像乳腺癌那样脱落那么多的ctDNA，例如成神经管细胞瘤和中枢神经系统肿瘤等。
总之，该研究报道了一种简单实用的DNA突变检测方法，可以用来扩展临床标本中突变追踪的覆盖度、深度、准确性和效率。该方法打破了DNA测序中覆盖度与深度之间的矛盾，同时能够以低成本准确追踪数千个低丰度突变。此外，MAESTRO能够在液体活检中独特地追踪数千个全基因组肿瘤突变，可提高癌症治疗后MRD的检测，为数百万癌症患者带来更精确的治疗、护理方案。
参考文献
1. doi: https://doi.org/10.1101/2021.01.22.427323
2. Ludwig, L. S. et al. Lineage Tracing in Humans Enabled by Mitochondrial Mutations and Single-Cell Genomics. Cell 176, 1325–1339.e22 (2019).
3. Garcia-Murillas, I. et al. Assessment of Molecular Relapse Detection in Early-Stage Breast Cancer. JAMA Oncol (2019) doi:10.1001/jamaoncol.2019.1838.
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