1ml血液，准确率86%！谭蔚泓/韩达/张朝团队开发自动化DNA计算平台，实现4小时快速诊断急性呼吸道感染
急性呼吸道感染（ARIs）主要由细菌或病毒病原体引起，目前临床细菌和病毒感染很难快速区分。例如，一些疑似呼吸道感染的临床和急诊（ER），大多数感染源自病毒，但仍然用抗生素治疗，这导致了抗生素的过度使用，使得抗生素耐药性快速发展，并使医疗成本上升。
传统病原学诊断方法依赖于病原抗原或宿主遗传分子的鉴定。但是当病原体浓度过低时，这种方法无法可靠检测微生物的致病作用是来自于正常定殖还是感染。循环血白细胞对细菌和病毒病原体的反应不同，这为分析宿主外周血中的转录谱提供了诊断ARI的新策略。已有研究表明，通过高通量分析对病毒和细菌ARI的宿主转录谱进行表征，具有104个宿主基因的分类器可以在273个个体的队列中以87%的总体准确率诊断ARI。但由于数据周转时间和高成本，其很难在急诊室或诊所实施。
近期，浙江省肿瘤医院谭蔚泓院长、韩达与上海交通大学分子医学研究院张朝等团队在杂志Science Advances发表了题为“An automated DNA computing platform for rapid etiological diagnostics”的研究文章。研究团队开发了一个基于DNA计算的自动化平台，包含7种不同的mRNA表达模式，实现了在4小时内使用1ml血液样本对急性感染病因的准确和自动识别。与当前可用的其他方法相比，该自动化平台准确率达86%，无需计算机和实验室技术人员的帮助。
文章发表于Science Advances
为了建立一个有效的模型分类器来区分细菌和病毒ARI，研究团队选择了SVM来训练数据，以NCBI数据库（GSE63990）中113个病毒ARI和67个细菌ARI对应的宿主外周血的转录谱作为训练集。 以这些数据用于差异表达分析，目的是将样本分为细菌和病毒感染组。在经过多个计算机训练的模型中，研究人员选择了一个具有最高曲线下面积（AUC）值以及合理数量mRNA的分类器，包括7个mRNA，即SIGLEC1、LY6E、IFIT1、TRDV3、VNN1、CD177和ARG1。该模型通过训练数据库可以区分细菌和病毒ARI，AUC为0.94。研究人员还使用另一个NCBI数据集（GSE6269）验证了模型，获得的AUC为0.91（图1）。
图1.ARI诊断的DNA计算平台。来源：Science Advances
首先，研究人员用试剂盒从新鲜人全血中提取了总RNA，再用Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶将总RNA反转录成cDNA。然后，用特定引物对通过不对称聚合酶链式反应（LATE）-PCR方法，扩增获得cDNA。通过调整过量引物和限制引物的核苷酸组成和数量以及比率，PCR的指数扩增阶段可以快速切换到线性阶段（图2）。同时，研究人员通过控制扩增周期的数量，将扩增的单链DNA（ssDNA）产物保持在适当的浓度范围内，从而为后续DNA计算提供最佳条件。
图2显示了使用LATE-PCR从1fM至1pM的初始mRNA浓度扩增的ssDNA产物相对荧光单位。结果表明，mRNA初始浓度和cDNA最终浓度之间存在线性关系。总的来说，LATE-PCR可以帮助减少传统指数扩增导致的偏差，同时转换低浓度的mRNA输入至更高浓度的ssDNA不会干扰它们的原始比率。
图2.RNA扩增。来源：Science Advances
训练分类器的计算方案被抽象为三个子步骤，通过级联DNA链置换反应实现（图3）。结果发现mRNA VNN1、CD177和ARG1与细菌感染呈正相关，SIGLEC1、LY6E、IFIT1和TRDV3与细菌感染呈负相关。
与这7种mRNA相关的数值权重反映了它们在ARI诊断中的重要性，因此，研究人员设计了增殖探针（W探针），可以对每个cDNA扩增子的不同靶序列区域进行加权。为了促进W探针和cDNA输入之间的链置换反应，研究人员实施了热退火策略，观察到热退火后cDNA靶对报告探针有更好的响应（图3）。
接下来，研究团队将mRNA输入的不同权重相加以进行比较，并使用荧光报告探针检测了An的相加信号，获得了反映相应正确总浓度的匹配信号。随后，再减去两种不同类型的相加输入和之后，报告分类结果，即诊断结果。最后，研究人员使用36种不同的加权和组合验证了该过程，浓度范围为0至50nM。结果表明，较高浓度的加权和可以报告较高的信号。
图3.DNA分子分类器的验证。来源：Science Advances
为了证明该方法能够为ARI的临床诊断提供可靠的平台，研究人员使用80名ARI患者的全血样本（1ml）研究了其分类准确性。通过集成RNA提取器、机械样本装载机、热循环仪和荧光读取器，研究人员将诊断平台组装成一个完全自动化的流程。使用自动化工作流程直接读取这些样品的输出荧光后，结果显示，40个细菌感染样品中的34个被正确识别，灵敏度为85.0%，40份病毒感染样本中有6份被误诊为细菌，特异性为87.5%。该方法在临床样本中的总准确度为86.2%，AUC为0.88。
研究人员还使用其他临床可用方法对这些样本进行了分类，包括基于中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞百分比的CBC，以及同一队列的CRP检测。这两种方法获得的AUC在0.54和0.74之间，其准确性低于最新开发的DNA计算方法。此外，在完全自动化流程的帮助下，整个检测程序从原始血液样本到最终诊断结果仅需3.5-4小时，符合急诊和护理点设置中ARI诊断快速周转时间的需求。
图4.利用DNA计算平台自动诊断ARI病因。来源：Science Advances
综上所述，研究人员将有效的诊断模型和强大的DNA计算方案集成到ARI病因诊断的全自动化分类工作流中，实现了在4小时内使用1ml血液样本实现对急性感染病因的准确和自动识别。与当前可用的其他方法相比，该最新方法准确率高达86%，为急诊科或定点医疗机构的病因的准确、快速、低成本和自动化诊断创造了机会，同时为合理的抗生素使用和对抗新抗生素耐药性提供了指导。此外，DNA计算以低成本、自动化和方便的优点，将为更多的临床应用提供可靠选择。
参考文献：
Ma Q, Zhang M, Zhang C, Teng X, Yang L, Tian Y, Wang J, Han D, Tan W. An automated DNA computing platform for rapid etiological diagnostics. Sci Adv. 2022 doi: 10.1126/sciadv.ade0453.
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade0453
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