Nat Methods | 在单细胞水平同时检测转录因子、染色质可及性及转录组的新技术NEAT-seq
近日，斯坦福大学研究团队在《Nature Methods》上发表了题为“NEAT-seq: simultaneous profiling of intra-nuclearproteins, chromatin accessibility and gene expression in single cells”的研究文章，介绍了一种名为NEAT-seq的新型测序方法。NEAT-seq能够在单细胞中定量核蛋白以及染色质可及性和转录组，使研究跨越中心法则的调控机制成为可能。
研究团队利用NEAT-seq分析了CD4记忆T细胞，证明该方法可用于检测转录因子（TF）丰度、染色质可及性和基因表达之间的关系，并识别了部分通过转录、翻译和调控染色质结合实现调控活性的TF。此外，研究团队还将GATA基序中的单核苷酸多态性（SNP）与一个假定的靶基因进行了非编码全基因组关联研究，并使用NEAT-seq数据在内部验证SNP对GATA3调节的影响。
首先，研究人员将抗绿色荧光蛋白（-GFP）抗体与Cy5标记的80-bpssDNA寡核苷酸偶联，并使用该抗体对表达核定位GFP的人胚肾293（HEK293）细胞进行染色（图1a）。利用10X Genomics Multiomekit将核蛋白定量与scATAC-seq、scRNA-seq结合起来（图1b），检测了人K562和小鼠胚胎干细胞（ESC）的混合细胞，使用针对互斥TF和抗体相关标签寡核苷酸14（HTO）的抗体染色，以评估双峰鉴定和核蛋白丰度测量的特异性，成功实现固定单细胞中内源性核蛋白丰度、染色质可及性和基因表达的同时定量，开发出NEAT-seq测序方法。
图1. 使用寡抗体的核内染色方案能够同时分析单细胞中的核蛋白、染色质可及性和 RNA 转录物。
随后，研究人员应用NEAT-seq分析了由TF驱动的CD4记忆T细胞，使用scATAC-seq在人群中识别了7个集群，并基于主TF RNA和蛋白质丰度、全基因组范围内TF结合基序的可及性以及非典型表面标记表达来注释Th1、Th2、Th17和Treg簇。对每个TF的基于抗体的蛋白质检测结果显示，与RNA数据相比，已知TF驱动的细胞类型明显富集并提供了对目标TF更稳健的检测。
通过比较TF基因位点染色质可及性、RNA表达、蛋白质丰度和全基因组TF结合基序可及性，发现TF集群中存在多种不同的调节模式。GATA3显示出跨细胞的RNA表达和蛋白质水平之间的明显差异，ADT水平与GATA3基序可及性的全局变化相关。除了使用多模式检测TF本身的调节外，研究人员还将TF的蛋白质丰度与调节元件可及性和跨细胞基因表达的变化相关联，来揭示TF的下游增强子和基因靶标。
为了通过TF相关增强子（TF-peak-gene links）识别由每个TF直接调节的候选基因，研究人员将TF ADT相关基因与TF ADT相关scATAC-seq峰重叠，过滤了显著的峰-基因连接（图3a），并对显示TF丰度和基序可及性之间相关性的TF进行相关分析（图3b）。结果显示，对于与T细胞功能相关的Gene Ontology（GO），候选靶基因和相应的表面标记显著富集。此外，研究人员还推断这些TF峰-基因连接可用于解释非编码全基因组关联研究中SNP对TF活性的影响，并将SNP与推定的靶基因联系起来。验证结果印证了这一推断。
图2. 鉴定与主 TF 蛋白表达相关的峰-基因联系。
综上所述，NEAT-seq为研究表观遗传调节因子丰度对原始人类样本中染色质和基因表达状态的定量影响提供了一条新途径。此前，研究TF剂量依赖性效应的研究通常需要构建具有同态和无效等位基因组合的细胞系或诱导型表达系统，但NEAT-seq可以同时检测一组蛋白质在生物学相关环境中TF水平连续变化。由于核蛋白包含许多参与基因调控的蛋白质，因此将核蛋白水平与表观遗传和转录状态联系起来能为分析基因调控机制提供一种强有研究途径。
参考文献：
Chen, A.F., Parks, B., Kathiria, A.S. et al. NEAT-seq: simultaneous profiling of intra-nuclear proteins, chromatin accessibility and gene expression in single cells. Nat Methods (（2022)）. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01461-y
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