Nature子刊 | 基于组织特异性降解模式的ctDNA负荷评估新方法，可定量低成本追踪ctDNA动态和癌症进展
背景介绍
随着无创检测技术的发展，ctDNA在肿瘤临床检测中的指导意义愈发突显。ctDNA负荷评估可实时监控患者临床治疗过程中肿瘤动态，有助于及时调整诊疗方案。目前，基于NGS检测平台的ctDNA负荷评估主要包含基于SNV等位基因突变频率、拷贝数变异（CNA）、甲基化模式3种评估方法。基于SNV的ctDNA负荷评估通常需要覆盖几百个基因的panel且为超高深度测序，当目标基因不存在克隆性突变时，该计算方法则有可能受到挑战；基于低深度全基因组测序（lp-WGS）检测CNA以评估ctDNA含量的方法不适用于所有癌种，因为某些癌种可能没有足以进行分析的CNA水平。与前者不同，基于甲基化模式的ctDNA负荷评估或许为一种更加普适性的评估方法，但以CNA和甲基化为基础的ctDNA负荷评估不能与ctDNA肿瘤位点突变检测分析同时进行，而是单独分析。以上各方法的局限性凸显了对可同时进行癌症突变图谱分析和ctDNA负荷评估计算方法的需求。
近期，新加坡国家癌种中心、基因组研究机构、杜克-新加坡国立大学的研究团队在Nature Communications期刊上公布了一种基于组织特异性cfDNA降解模式建立的ctDNA负荷评估新方法。研究团队依据既往研究观点，即核小体耗尽区（NDR）因频繁的降解可在cfDNA 图谱中产生核小体依赖性的降解足迹，该特征可用于cfDNA组织溯源。该研究证实了新的评估模型可适用于结直肠癌和乳腺癌，绝对误差≤4.3％。此外，研究团队还探索了如何使用低成本的cfDNA靶向测序来定量监控患者的ctDNA动态。
文章发表在Nature Communications上
研究方法
该研究共收集了29例健康个体样本和101例癌症患者样本（结直肠癌患者（CRC）65人，乳腺癌患者（BRCA）36人）。其中，健康个体血液样本采用双端WGS测序，癌症患者血液样本和对应明确高ctDNA负荷组织样本通过超高深度靶向测序，并对该部分样本进行90x cfDNA WGS测序。为确定可用于评估ctDNA负荷的NDR特征，研究团队鉴定了健康个体和癌症患者样本中特异性NDR，并分析了启动子和第一个外显子-内含子连接处NDR cfDNA的降解差异。通过计算机模拟数据和机器学习，对基于NDR cfDNA覆盖度预测ctDNA负荷的线性模型进行了模型训练和测试。最后，使用53例CRC数据探索了基于NDR靶向测序方法的准确性并评估了5名CRC患者的ctDNA负荷。
图1.研究方法概览，来源：Nature Communications
研究结果
1
启动子、第一外显子-内含子连接处NDR cfDNA覆盖度与基因表达呈现强负相关
既往研究证实，启动子以及外显子-内含子连接处均与NDR密切相关。该研究分析结果发现，转录本的第一个外显子-内含子连接处的覆盖度与基因表达密切相关，其中在-300bp至-100bp范围NDR区域的cfDNA覆盖度与基因表达成强负相关（图2a）。同时，研究团队还比较了高表达（fpkm≥30）和未表达基因与cfDNA NDR覆盖度的关系，结果发现启动子和第一外显子-内含子连接处NDR的cfDNA覆盖度之间存在很强的正相关（图2b）。但NDR cfDNA覆盖度并不能区分表达与未表达的基因（图2b，c），这表明除基因表达以外的其他因素也参与了NDR cfDNA的降解。
图2.基因启动子区域以及外显子-内含子连接处cfDNA降解特征，来源：Nature Communications
2
PPP1R16A、GMFG基因的NDR cfDNA覆盖度可用以识别CRC患者与健康人群
研究团队利用TCGA和GTEx数据库筛选了CRC患者和健康人群特异性表达基因，发现PPP1R16A、GMFG基因可分别作为CRC患者、健康人群的特异性表达基因。PP1R16A在癌症患者中NDR cfDNA的覆盖度显著低于健康人群，GMFG则相反（图3a）。进一步分析结果显示，CRC特异基因在启动子区域和第一外显子-内含子连接处均表现出明显的NDR cfDNA消耗（图3b）。
图3.CRC患者ctDNA负荷定量评估，来源：Nature Communications
3
6个基因可用于定量评估CRC患者的ctDNA负荷
通过利用健康人cfDNA稀释CRC患者ctDNA，研究团队模拟出231例训练组数据和113例测试组数据，模拟ctDNA含量从0.5%至正常值。根据基因表达水平和NDR cfDNA降解特征，入组了CRC特异性高表达且启动子区域和第一外显子-内含子连接处NDR cfDNA低覆盖度基因，以及健康人群特异性表达基因。最终，训练组筛选出6个可用于评估ctDNA负荷的NDR基因（图4）。
图4. 6个可用于评估 CRC ctDNA负荷基因的NDR特征。注：fpkmCRC为结直肠癌患者血液，fpkmblood为健康人群血液样本数据。来源：Nature Communications
4
靶向NDR测序分析可用于CRC ctDNA负荷评估和疾病动态监控
针对筛选出的6个CRC患者ctDNA负荷评估基因，研究团队设计了NDR探针，并对53个CRC血液样本进行了300x靶向测序，以探索一种低成本且高准确性的ctDNA负荷评估靶向测序panel。此外，研究人员还将其与传统的CNA和SNV ctDNA负荷评估方法进行比较。结果显示，NDR ctDNA负荷评估方法与CNA/SNV ctDNA评估方法高度一致（图5 b/c）。将靶向NDR测序应用于5位CRC患者，发现NDR ctDNA动态与CRC患者的疾病进展和SNV突变频率变化基本一致（图5d），证实靶向NDR测序的临床应用价值。
图5.靶向NDR测序分析可用于ctDNA负荷评估和癌症进展动态监控，来源：Nature Communications
5
通过量化cfDNA图谱偏离健康基线图谱的程度，预测不同癌症的ctDNA负荷
研究团队分析了是否可通过量化cfDNA图谱偏离健康基线图谱的程度预测不同癌症类型的ctDNA负荷。结果如图6a显示，研究筛选出在健康个体血液样本中NDR低覆盖的基因。为了系统验证该观点，研究团队利用BRCA患者和CRC患者样本、健康人群中高表达的特异性基因并分析NDR特征（图6b）。结果显示，可通过量化cfDNA图谱偏离健康基线图谱的程度预测CRC、BRCA的ctDNA负荷，且该方法检测CRC ctDNA负荷与CRC特异性基因检测NDR ctDNA负荷的准确性基本一致。
图6.适用于两种不同癌症的NDR ctDNA评估方法，来源：Nature Communications
小结
综上所述，研究团队构建了基于NDR特征的ctDNA负荷评估方法，该研究方法可同时进行ctDNA负荷评估和肿瘤药物敏感性SNP检测，且仅仅需要10个或更少基因。此外，既往研究证实NDR ctDNA负荷评估的准确性明显优于低深度WGS测序的CNA ctDNA评估方法。因此NDR ctDNA负荷评估是一种经济且高精度的检测方法。同时研究团队指出，该研究的训练组数据和测试组数据主要为机器模拟数据，仍需更多的真实研究数据以评估该检测方法的技术偏差和检测下限。
参考文献
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