人体外培养细胞毒性T总结
细胞毒性T淋巴细胞（CTL）是T淋巴细胞的一个亚群，可分泌各种细胞因子参与免疫作用，其与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。细胞毒T细胞高效扩增技术可以从单个核细胞（MNC）在体外高效扩增成细胞毒性T细胞。扩增的细胞毒性T细胞（CD3+CD8+）纯度可以在80%左右,为免疫学研究提供了一个有力武器。
【操作步骤】
所需试剂：
1 IMDM，α-MEM或RPMI-1640
2 FBS
3 DNase I
操作流程：
1准备好37°C水浴，将RPMI-1640与FBS温浴至37°C；
2生物安全柜中，配制含10%FBS的培养基（IMDM, α-MEM或RPMI-1640均可），待用；
3从液氮中取出人体外培养细胞毒性T细胞冻存管，置于-80°C超低温冰箱中数分钟，使冻存管中的液氮挥发，而后迅速将其置于37°C温水中，并快速水平晃动，使其内含物尽快融化，直至冻存管固体内含物余下一小冰屑后取出冻存管；
注意：
1）从液氮中取出冻存管时，往往在冻存管里含有液氮，最好先将冻存管先置于超低温冰箱中，使液氮挥发，再进行水浴化冻的操作；
2）尽可能将冻存管的内含物全部浸没于37°C温水中，使内含物均匀融化；
3) 请勿使温水没过冻存管盖的螺口，以防污染；
4) 细胞复苏的操作过程要迅速，避免影响细胞复苏后的活性。
4在将冻存管拿进生物安全柜之前，用75%酒精对其表面进行消毒；
5轻轻重悬细胞，并将其移入装有100μg DNase I的50mL离心管里；
注意：
1）加入DNase I可有效减少细胞复苏后细胞团块的产生；
2）DNase I的使用是非必须的，对于DNA, RNA等的提取目的可不使用。
6用1mL培养基冲洗冻存管，并将此悬液以3-5s每滴的速度滴加到50mL离心管中，并且同时
轻轻摇晃离心管，使滴加的悬液混匀；
7吸取15-20mL的培养基以3-5s每滴的速度滴加到50mL离心管中，并且同时轻轻摇晃离心管，
使滴加的悬液混匀；
注意：第5,6,7步骤可使细胞中的DMSO缓慢均匀的渗透出来，最大程度保证细胞安全，但操作较为缓慢，若有多个样品需要处理时，可以将操作步骤更改为：
5’：轻轻重悬细胞，并将其移入装有100μg DNase I的15mL离心管里；
6’：用1mL培养基冲洗冻存管，并将此悬液合并到到15mL离心管里；
7’：吸取10mL培养基，直接加入到15mL离心管中，反复轻柔吹打或上下颠倒混匀，室温孵育10min；
8室温下，300g离心10min；
9迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使细胞悬浮；
注意：
1）离心结束后，尽快吸走上清；
2) 吹打液体时动作要轻，避免损伤细胞，并且吹打时尽可能避免气泡产生。
10缓慢加入15-20mL新鲜培养基（快速法中则只要在15mL离心管中加入10mL培养基即可），
并同时轻轻摇晃离心管；
11室温下，300g离心10min；
12迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使细胞悬浮，即可用于下游实验。
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