人广谱特异性杀伤细胞高效扩增经验总结

细胞毒性T细胞（CTL细胞），能识别带特异性抗原的靶细胞，并通过分泌穿孔素，颗粒酶，肿瘤坏死因子的途径杀伤靶细胞，因此在抗病毒感染、同种异体移植排斥反应和抗肿瘤免疫中起重要作用。本试剂盒适用于从单个核细胞（MNC）在体外高效扩增成广谱特异性杀伤细胞，所生成的CTL可识别例如Her-2，Muc1等多种抗原表位。

【操作步骤】

一 外周血单个核细胞提取

1 肝素钠管或枸橼酸钠采血袋采集外周血150mL；

注意：禁止使用EDTA抗凝剂采集血液。

2 取50mL离心管，分别加入15mL 淋巴细胞分离液，并将1步骤中的血液分别缓缓铺加到淋巴细胞分离液的上层；

注意：铺加血样时建议速度适中，尤其是刚开始时的铺加， 避免破坏淋巴细胞分离液与血样的界面。

3 室温下，800g 离心20min（无闸减速）；

4 离心后，离心管中样品由上到下分为 4 层：血浆层-白膜层-人淋巴细胞分离液层-红细胞与粒细胞的沉淀。分别小心吸取白膜层及其以下约一半的液体于新的离心管中，并加入生理盐水或PBS至40mL体积，混匀，300g离心10min；

5 弃上清，沉淀再次用40mL的生理盐水或PBS重悬，300g离心10min；

6 弃上清，细胞沉淀即为PBMC，待用。

二 DC细胞诱导

1 第0天，预先配置DC细胞诱导培养基（含90ml CTL培养基-I，10ml CTL培养添加剂，30uL的CTL-I因子和10uL CTL-I因子）；

2 取<外周血单个核细胞提取>步骤中所得的PBMC细胞，用100ml 的RPMI 1640培养液重悬，分别铺于2个T-75培养瓶中（即每个培养瓶铺有50mL的PBMC悬液），置于37℃、5% CO2培养箱孵育2h；

注意：建议采用无TC处理的培养瓶培养，以减少后续DC细胞的贴壁情况。

3 孵育2h后，轻晃T-75培养瓶，将未贴壁的细胞悬浮起来，收集，用于T细胞的激活（T细胞的激活见于后续介绍）。用20ml的RPMI 1640培养液或PBS洗涤T75瓶两次，洗涤完毕后，在每个培养瓶中均加入50ml预先配置好的DC细胞诱导培养基，继续置于37℃、5%CO2培养箱；

注意：在洗涤时，可用移液管吸取RPMI 1640或PBS轻轻冲洗贴有细胞的培养瓶瓶壁，以去除更多没有贴壁的淋巴细胞。

4 第2天（2×24h），每个培养瓶分别加入2mL的CTL-VI因子，轻轻摇匀；

5 12h后，每个培养瓶分别加入25μL的CTL-III因子，50μL的CTL-IV因子与15μL的CTL-V因子；

6 第4天，收获DC细胞，待用。

三 T细胞激活

第0天，将<DC细胞诱导>操作中第0天T75瓶孵育2h后悬浮起来的细胞按1-1.5x10⁶/mL细胞密度接种于新的T-75细胞培养瓶中，加入100μL的CTL-VII因子，1mL的CTL-VIII因子以及IL-2（IL-2的终浓度为500 IU/mL）；

注意：T细胞的激活操作同时于DC细胞的诱导操作，即一份PBMC细胞，接种于T75瓶后，贴壁的细胞用于诱导培养DC细胞，而贴壁后所剩的悬浮细胞则用于T细胞的激活。

四 特异性杀伤细胞的生成

1第4天，此时DC细胞成熟，并且T细胞已被激活。收集<DC细胞诱导>步骤中两个T75培养瓶中已成熟的DC细胞，300g离心10min；

注意：有的样本有较大量DC细胞贴壁的现象，可先将悬浮的细胞收集后，再用10mL移液枪吸取PBS或生理盐水反复吹打，而后合并。

3收集< T细胞激活>步骤中的T细胞，300g离心10min；

4 弃上清，T细胞沉淀用100mL新鲜CTL培养基-II（含500U/mL的IL-2）重悬，并将孵育完毕的DC细胞悬液加入T细胞悬液中，轻轻混匀后，加入到T75培养瓶中，培养瓶竖立于37℃、5%CO2培养箱中培养，12h后，将培养瓶放平，继续培养；

5 第6天，补加100ml CTL培养基-II（含IL-2 500U/ml），转入细胞培养袋，此时每袋含200ml培养液；

6 第8天，补加200ml CTL培养基-II(含IL-2 500U/ml)，此时每袋含400ml培养液；

7 第10天，补加400ml CTL培养基-II(含IL-2 500U/ml)，此时每袋含800ml培养液；

8 第12天，补加800ml CTL培养基-II(含IL-2 500U/ml)，分成两袋，此时每袋含800ml培养液；

9 第14天，每个培养袋均补加200ml CTL培养基-II(含IL-2 500U/ml)，每袋培养液总体积1000ml；

10第16天，收获广谱特异性CTL细胞。