合成生物学赋能技术加速工程抗体开发

单克隆抗体在对抗由病毒、细菌和原生动物等单细胞生物引起的传染病方面表现出良好的有效性，在治疗、诊断和靶向药物递送等多个领域具有广阔的应用前景。多年来，科学家们一直在寻找可以替代传统技术的最佳技术，以帮助提高抗体开发的效率，满足癌症、自身免疫性疾病、慢性疾病及其他各种疾病的治疗需求。蛋白/抗体工程的出现为开发有价值的蛋白及抗体提供新颖的设计方法、灵活的生产技术和修饰策略，有助于开发有效抗体的创新。

抗体工程技术

1) 抗体人源化是抗体工程的根本

1975 年，骨髓瘤细胞系与免疫动物的B细胞融合的杂交瘤技术的发展使抗体工程成为可能，至今，杂交瘤技术仍然是生产单克隆抗体的核心技术之一。为了降低鼠源抗体所引发的免疫原性等问题，嵌合抗体和抗体人源化逐渐变得司空见惯。嵌合抗体保留了杂交瘤产生的小鼠抗体的整个可变区序列，因此，嵌合抗体的氨基酸序列仍有大约1/3是非人源的。而人源化抗体包含更高百分比的人源序列，只有小鼠CDR区被保留，其余的恒定区和可变区框架是人源的。然后，在某些情况下，将小鼠高变区移植到人源框架上会导致抗原结合减少，因此，通过计算机设计或体外抗体文库筛选等技术进行亲和力成熟必不可少。此外，还有两种产生全人源抗体的方式，即通过使用含有人抗体基因的转基因动物的杂交瘤产生全人源抗体，以及从受感染病人或患有癌症的病人体中分离B细胞，形成人杂交瘤细胞，并从中分离出人源抗体。

2) 鉴定抗体基因是抗体工程的前提

另一种鉴定感兴趣的单克隆抗体的策略是直接对从免疫动物或人类的杂交瘤、B细胞中分离抗体基因进行测序，一旦确定了编码VH和VL结构域的正确基因，就可以进一步组装成多种适合表达或操作的形式，对于指导抗体的合理设计至关重要。如VH链一般非常不稳定并且容易在体内聚集，但是在骆驼或美洲驼中发现单独存在的VH链，且表现出高的抗原亲和力，对其序列和结构分析已被用于指导人类VH链突变的合理设计，使其在没有VL链的情况下依然保持稳定。

3) 抗体表达系统是抗体工程的基石

抗体技术的一场始于 1980 年代后期，当时开发了用于在细菌中克隆和表达抗体基因的高效系统。虽然大肠杆菌等细菌系统可能难以产生复杂的全长蛋白质，但它们已显示出在生成抗体片段（如Fab和Fv）方面的实用性，因为这些抗体片段不需要糖基化即可实现其预期功能。通常将抗体产物转运到周质的革兰氏阴性菌相比，革兰氏阳性菌具有将蛋白质直接分泌到培养基中的优势。酵母毕赤酵母和昆虫细胞真核蛋白表达系统，保留了原核系统的一些优点，同时还能够对表达的蛋白质进行翻译后修饰。尽管这些细胞中的糖基化与人类细胞的糖基化不同，但糖基化酶的细胞工程为其生产具有适当效应功能的抗体提供可用性。但是内源性人类抗体往往具有丰富的糖基化，正确糖基化对于抗体的溶解度、稳定性和效应功能至关重要，进而影响抗体药代动力学功能。所以，越来越多的治疗性抗体更倾向于在哺乳动物细胞中产生。如人类胚胎肾293(HEK293)及其衍生物细胞，具有良好的转染效率，通常用于发现阶段的重组抗体表达。中国仓鼠卵巢(CHO)系为代表的非人类哺乳动物细胞，由于其全面的表征、高蛋白产量和稳定转染的能力，被用于生产大多数抗体治疗药物。

泓迅科技抗体工程一站式服务

泓迅科技作为合成生物学赋能技术的领导者之一，建立了全面的抗体工程一站式服务平台，提供基于抗体“读”（测序&设计）—“写”（合成&表达）—“编”（亲和力成熟&人源化&耦连）全方位的技术服务，为科研院所和生物制药公司提供高效、高品质、高性价比的技术支持。

图1 抗体工程一站式服务流程图

一、抗体基因测序

泓迅科技曾采用RACE技术，定制引物集，及专用自有试剂，成功测定了数千个杂交瘤细胞的抗体基因序列。利用二代测序更高的灵敏度及精度的特点，公司进一步升级了杂交瘤抗体基因测序技术，将转录组测序及生物信息学分析相结合，将杂交瘤测序的成功率提高至99%，也为多种物种样本与困难样本的测序提供了可能性。

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图2 测序数据的VH/VL分析结果

二、重组抗体表达

泓迅科技为重组抗体的工业化生产探索了整体方法，以帮助客户更快地推动科研项目和候选药物开发的进展。从密码子优化、基因合成&克隆、转染级质粒制备到重组抗体生产只需要几周时间，获得的高质量、高纯度抗体产品可以满足绝大多数研发需求。同时，公司还可提供稳转细胞株构建及Pool筛选服务，在CHO表达系统中，配合嘌呤霉素+MTX筛选，获得可稳定表达目标蛋白的细胞株，进一步稳定重组抗体生产的质量及产量。

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图3 重组抗体表达和纯化

图4  GFP-CHO稳转株阳性率检测，显微镜下观察荧光细胞所占比例大于90%

三、抗体人源化

泓迅科技基于计算机建模和模拟技术，开发了一套集成的抗体人源化和亲和力成熟平台。该平台通过对10万多个人源抗体序列的初始筛选,并依据同源性、关键残基位点等因素呈现出200个高匹配度的结果，然后分析每个序列及其CDR移植的适宜性筛选出具有与亲本抗体相当或更好的特异性、生物活性、热稳定性和生产力的人源化抗体以供表达。

图5 抗体人源化服务流程

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利用泓迅科技SynoAbTM平台，设计并筛选了25个人源化抗体，通过Elisa检测结果，选择H5L4、H6L4、H5L6、H7L6 四个抗体进行下一步亲和力检测（H1L1为对照），结果如下图所示：

图6 人源化抗体亲和力检测结果

四、合成抗体文库

泓迅科技依托先进的设计和领先的制造成功交付了数百个高质量、定制库化、精准合成的突变文库，通过高合成效率的Trimer引物构建的抗体文库为抗体亲和力成熟、药物靶标筛选、特异性抗体发现等多种突破性研究提供了技术保障。在Trimer文库中，研究人员可以通过精确控制CDR区域中每个突变位点的氨基酸种类和比例，提高突变文库的精度，降低后期筛选难度，省时省力还具备高性价比等优势。

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图7 突变文库举例

泓迅科技以合成生物学思维为导向，可为每位客户制定专属实验方案，以指定形式表达的优质抗体满足您特定的实验需求，简化您的抗体发现流程，缩短抗体药物研发周期。识别屏幕下方二维码，快来咨询、订购吧！

参考文献：

[1] Goulet DR, Atkins WM. Considerations for the Design of Antibody-Based Therapeutics. J Pharm Sci. 2020;109(1):74-103.

[2] Maynard J, Georgiou G. Antibody engineering. Annu Rev Biomed Eng. 2000;2:339-76.