人源化单克隆抗体CD28

 

单克隆抗体(Mab)目前已被纳入恶性肿瘤、移植排斥、自身免疫和传染病等以及一系列新适应症的靶向治疗方案。而人源单克隆抗体(Human monoclonal antibody，HuMAb) 更是成为未来抗体发展的主要研究方向。HuMAb是指完全由人类基因编码表达的单克隆抗体，它具有更丰富的表位、更低的免疫原性、更长的半衰期、更佳的生物活性等优势，使之在体内中发挥着良好的用途，如体内诊断、传染病预防、抗体疗法和疾病预后判断等。其中，CD28作为一个机制清晰的老靶点，它在免疫治疗中发挥着重要的价值。

CD28分子是由二硫键合的44 kDa亚基组成的同源二聚体糖蛋白。每个CD28单体含有134个细胞外氨基酸，具有单个跨膜结构域和短细胞质尾。CD28的细胞外结构域与免疫球蛋白可变区域结构域显示其同源性。CD28分子的编码基因由四个外显子组成，每个外显子分别定义其蛋白质的功能结构域。

CD28共刺激作用

 

T细胞的完全活化依赖于T细胞抗原受体（T-cell receptor, TCR）提供的抗原刺激信号和共刺激受体提供的共刺激信号。CD28是T细胞中关键的共刺激受体，它调控T细胞的发育、分化、代谢、迁移等生理过程[1] 。初始T细胞的完全活化通常需要三个信号，第一信号是抗原和抗原受体的结合，第二信号是共刺激信号，第三信号是细胞因子信号。CD28作为共刺激分子，参与了第二信号的接收。

对于Tc细胞（细胞毒性T细胞）和Th细胞（辅助性T细胞）来说，共刺激信号传导降低了T细胞活化的阈值，促进了T细胞的增殖和分化。在没有CD28共刺激存在时，初始T细胞不会被活化，也不会发生应答。CD28参与的共刺激过程能产生多方面重要的分子效应：

1. 诱导T细胞表面IL-2R（白介素-2受体）的表达，从而  允许细胞接收第三信号；

2. 使Th细胞开始分泌大量的细胞因子和趋化因子；

3. 诱导表达和上调表达在Th和Tc细胞内其他共刺激和调节分子[2]。

当DC（树突状细胞）表面的特异pMHC结合了初始Th或Tc细胞表面多拷贝的某个TCR时将传递第一信号。TCR和pMHC结合，将导致与TCR紧密相邻的CD3链上ITAM被Lck激酶磷酸化。其他胞内信号转导相关酶随后被募集到此处，与CD4或CD8共受体及CD3链的胞质尾区相接触。这些酶一起介导酶级联化学反应，导致其他多个酶的活化。当这种活化级联反应出现于多个TCR时，T细胞将接收到第一信号 [2] 。

在多数情况下，TCR和pMHC的结合不足以完全活化一个初始Th细胞或Tc细胞，共刺激信号传导形式的第二信号是必需的。对于Th细胞，接收第一信号后导致Th细胞表面的重要共刺激分子CD28的表达上调。然而CD28要传递第二信号到Th细胞核内，其必须同递呈活化性pMHC的DC表面的配体B7分子相结合。当免疫突触最初开始形成时，成熟的DC细胞并没有表达最佳水平的B7分子，第一信号传递到Th细胞及CD28和B7最初结合的关键结果是Th细胞表面跨膜蛋白CD40L的表达上调，一旦Th细胞表面的CD40L与DC表面的CD40结合，DC将大大提高其B7的表达及随后其同Th细胞表面CD28的更强结合。最终，强有力的第二信号被传递到T细胞内，从而提高活化性胞内信号传导，而这种出现在T细胞内的活化信号转导也是第一信号的结果。

CD28研究进展

 

由于CD28表达于T细胞表面，且CD28分子的表达情况在健康人中具有一定的年龄相关性[3]。人刚出生以后，人体体内循环中几乎没有CD28-T细胞，但随着年龄的增加，CD28-T细胞的数量便逐渐增多。CD28分子的缺失减少了T细胞抗原受体的多样性，抑制了抗原诱导的增殖[4]。CD28表达减少通常被认为是T细胞衰老的标志[5]，且CD28缺失是老年人免疫功能不全的关键预测因子。

抗CD28单克隆抗体通过靶向CD28分子胞外结构起作用，根据其靶抗原表位及其对T细胞的刺激活性可大致分为2类：常规抗CD28特异性抗体和抗CD28超激动抗体（又名CD28超激动剂，即CD28sa）。在大多数药物研发中，抗CD28抗体药物主要是指CD28sa。

早期的CD28sa分子起源于1990年后期Thomas Hünig的实验室，其基于大鼠模型为类风湿性关节炎（RA）、多发性硬化症、格林-巴雷综合征或1型糖尿病等自身免疫性疾病开发的免疫疗法项目。

然而，CD28的靶向治疗手段的应用却是“命运多舛”。2006年，CD28激动剂（TNG1412）进入临床实验，但却以悲剧收场，并成为当年免疫治疗领域的头条新闻。尔后，TNG1412更名TAB08。研究发现，当浓度控制在较低水平时，试验效果良好，目前仍处于临床试验阶段用于肿瘤治疗；2016年，强生公司的CD28单抗药物（FR04）能够抑制T细胞的增殖，活化以及阻断信号通路来达到免疫耐受的效果；2020年10月，首款CD28拮抗剂免疫疗法FR104获得欧洲专利；近年来科研人员对CD28 单克隆抗体的研究依然没有停止......

 研究1

南方科技大学的田瑞军、Li Pengfei和来自中国科学院大连化学物理研究所的王方军在《Cell Chem. Biol.》期刊上发表了一篇以“Motif-DependentImmune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics”为题的论文[6] 。

他们利用CD28通过酪氨酸磷酸化(pY)这种翻译后修饰激活，然后招募下游信号蛋白形成复合物。这些复合物对于T细胞的激活与TCR信号通路至关重要，因此分析其相互作用组有助于更全面地理解CD28的调节功能及其在免疫治疗中的应用。

研究2

2017年10月，中科院生物化学与细胞生物学研究所许琛琦研究组与牛津大学Omer Dushek研究组合作在《Nature Structural & Molecular Biology》在线发表了题为“Dynamic regulation of CD28 conformation and signaling by charged lipids and ions”的论文[7]。

该项研究揭示了CD28的活性调控机制以及T细胞高抗原敏感性的信号基础，提出了TCR-Ca2+-CD28所组成的正反馈调控环路可以迅速放大T细胞信号强度的机制；揭示了TCR-Ca2+-CD28之间由此形成了正反馈环路，可以迅速放大抗原刺激信号，从而为T细胞产生高抗原敏感性提供信号基础。

 总结    

 

无论是抗肿瘤免疫治疗还是器官移植后免疫抑制治疗，以及机会性感染的控制，共刺激分子CD28都不失为一个有用的敏感靶点。通过流式技术监测免疫细胞的表型，能够为临床研究和治疗提供有关受体免疫状态极具价值的信息。我们相信，在未来几年里，市场上将会有越来越多以CD28为靶点的生物制剂，为广大深受免疫疾病困扰的患者带来福音。

同立海源CD28验证数据

高纯度HPLC和SDS-PAGE验证
 

测试结果显示纯度达到药用级标准（≥95%）

高生物活性经细胞水平生物活性验证
 

流式细胞术检测CD28抗体与Jurkat细胞

（人外周血白血病T细胞）

表面CD28的结合活性，CD28抗体在低浓度

100-300ng/mL下仍然表现出优良的结合能力

参考文献：

[1]Chen, L. & Flies, D.B. Molecular mechanisms of T cell co-stimulation and co- inhibition. Nat. Rev. Immunol. 13, 227–242 (2013).

[2]塔克·马可、玛丽·桑德斯．免疫应答导论：科学出版社，2012：159-160

[3]FAGNONI F F, VESCOVINI R, MAZZOLA M, et al. Expansion of cytotoxic CD8+ CD28- T cells in healthy ageing people, including centenarians [J]. Immunology, 1996, 88(4): 501-7.

[4] QIN L, JING X, QIU Z, et al. Aging of immune system: Immune signature from peripheral blood lymphocyte subsets in 1068 healthy adults [J]. Aging (Albany NY), 2016, 8(5): 848-59.

[5] VALLEJO A N, NESTEL A R, SCHIRMER M, et al. Aging-related deficiency of CD28 expression in CD4+ T cells is associated with the loss of gene-specific nuclear factor binding activity [J]. J Biol Chem, 1998, 273(14): 8119-29.  

[6]Motif-DependentImmune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics,Xiong Chen, Shanping Ji, Zheyi Liu, et al.Cell Chem. Biol.DOI：10.1016/j.chembiol.2022.01.005.

[7]Dynamic regulation of CD28 conformation and signaling by charged lipids and ions,Wei Yang,Weiling Pan,Shuokai Chen,et al.Nature Structural & Molecular Biology,2017-10-23 , DOI: 10.1038/nsmb.3489 .

关于同立海源
 

北京同立海源生物科技有限公司，成立十余年专注细胞和基因治疗（CGT）上游GMP级原料试剂研发，致力于为生命科学提供可靠的产品与服务。产品涉及真核重组蛋白、细胞分选试剂、无血清培养基、细胞培养试剂盒、工具酶。为细胞和基因治疗、mRNA开发、抗体药物开发、细胞储存等生物制药和IVD领域提供核心原料试剂与服务。

公司建有符合cGMP标准的万级洁净车间，包括哺乳动物细胞表达蛋白质工程平台、细胞培养技术开发平台、体外诊断试剂生产平台，通过ISO13485和ISO9001双认证，部分产品已获美国FDA DMF备案。