Nature Biotechnology｜最新基因编辑技术可在人类细胞RNA水平进行大规模平行基因筛选
来源：New York Genome Center
近年来，可靶向RNA的Cas13酶成为CRISPR基因编辑领域的新宠。Cas13酶具有RNA介导的RNA酶切活性。目前为止，Cas13酶是第二大类CRISPR-Cas系统能够降解RNA的蛋白的唯一角色，可在不改变基因组的情况下影响基因表达。在CRISPR-Cas13系统中，Cas13需要借助向导RNA（gRNA）来找到靶标RNA，进而完成切割。gRNA与靶标序列匹配程度越高，Cas13切割效果越好，并可降低脱靶效应，因此，gRNA的设计至关重要。
近日，Nature Biotechnology发表了关于RNA基因编辑的重要研究成果。为提高CRISPR系统的RNA靶向性，来自纽约基因组中心和纽约大学的Neville Sanjana博士研究团队通过优化靶向RNA的CRISPR技术设计了一个筛选平台，并制定gRNA的设计规则。该平台可用于人类细胞中RNA水平的大规模平行基因筛选，有助于了解RNA调节，识别非编码RNA的功能。此外，针对人类RNA转录组中成千上万个不同的位点，研究人员开发了一种基于Cas13的机器学习预测模型，可快速识别最有效的gRNA。文章题为“Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design”。
来源：Nature Biotechnology
文章通讯作者Neville Sanjana博士表示：“该系统依赖于Cas13酶，该酶与gRNA结合，并与互补的信使RNA结合。gRNA和信使RNA之间的匹配越好，Cas13的基因沉默作用就越有效。靶向RNA的Cas13酶将对分子生物学和医学应用产生重大影响，但对于具有高靶向效力的gRNA设计我们知之甚少。通过深入而系统的研究，可为最有效的gRNA设计制定关键原则和预测建模。”
为定义Cas13酶指导RNA的设计原则，研究团队利用可靶向RNA的Cas13，针对绿色荧光蛋白转基因的信使RNA以及人细胞中的CD46、CD55和CD71细胞表面蛋白进行了大规模平行筛选。该研究共检测了24,460个gRNA的活性，并分析了其与靶标序列的错配情况。
研究团队涉及的gRNA跨越许多不同的转录组。在此过程中，研究团队获得了一些有趣的生物学发现，或可扩大Cas13酶的应用范围。例如，研究团队发现了gRNA的哪些区域甚至哪几个位点对于识别靶RNA更为重要。利用成千上万个与靶标RNA具有1、2或3个单碱基错配的gRNA，研究人员鉴定了一个对gRNA与靶标RNA之间的错配非常敏感的关键区域。这一发现将有助于科学家设计gRNA，以避免在非靶标RNA上的脱靶活性。
由于典型的单个人类细胞约表达100,000个RNA，因此Cas13能够准确靶向目标分子对于筛选和治疗应用至关重要。研究团队针对人类RNA转录组中成千上万个不同的位点，开发了一种基于机器学习的预测模型，可加快识别最有效的gRNA。
在验证通用性后，研究人员检测了针对48种内源基因的3979种mRNA。结果表明，Cas13可用于正向转录组筛选，并且该机器学习模型可预测人类基因组中所有蛋白质编码转录组的优化Cas13 gRNA。总体而言，该最新研究将此前Cas13在哺乳动物细胞研究中的位点数量增加了两个数量级以上。
除了加深对Cas13脱靶的了解外，关键区域还可用于更精确地区分密切相关的RNA物种。值得关注的是，研究人员于1月底开始研究针对SARS-CoV-2的Cas13。根据武汉早期患者分离的病毒RNA基因组，利用该平台和预测模型设计了优化的Cas13 gRNA，使其靶向SARS-CoV-2。随后又利用预测模型对纽约分离出的新型冠状病毒SARS-CoV-2进行了关键分析，预测了可用于未来检测和治疗应用的最佳gRNA。相关结果已在网上公布（http://bit.ly/coronavirus-guides）。
图：文章作者：Hans-Hermann Wessels、Alejandro Méndez-Mancilla、Neville Sanjana（从左到右）来源：New York Genome Center
论文发表后，已有数个公共卫生和药物研发小组与研究团队取得联系，寻求可能的合作伙伴关系。Sanjana博士表示：“我们欢迎来自学术界，行业和资助者的合作伙伴，以帮助我们加快使用Cas13对抗SARS-CoV-2和其他RNA疾病载体的研究进展。目前，我们与已经与相关病毒实验室合作，并检测不同的CRISPR疗法阻断病毒的功效。
文章共同第一作者Méndez-Mancilla表示：“使用优化的Cas13筛选系统靶向非编码RNA令我们特别兴奋。这极大地扩展了CRISPR工具箱在正向遗传和转录组筛选中的应用。”
纽约基因组中心Tom Maniatis博士表示：“这是在纽约基因组中心开发的技术创新。这项最新CRISPR技术对推动基因组学和精准医学发展具有重要意义。”
借助CRISPR技术，科学家已经鉴定了镰状细胞性贫血、肺癌转移以及许多其他疾病的关键基因。但传统的CRISPR技术基因筛选范围有限：只能编辑或靶向DNA。人类基因组的某些区域以及其他部分生物，例如冠状病毒或流感病毒等RNA病毒，无法通过靶向DNA的CRISPR技术完成筛选。
可靶向RNA的CRISPR-Cas13系统为以上问题提供了解决方法。这项发表在Nature Biotechnology的最新研究，定义了Cas13 gRNA的设计规则，并可通过预测模型识别最有效的gRNA，提高了CRISPR系统靶向RNA的效率。由于RNA病毒具有变异快的特点，因此更快更准确地设计出最佳gRNA，有助于加速CRISPR系统的病原体诊断。
目前，研究人员可以通过网站和开源工具箱使用该机器学习模型，以预测gRNA效率，并为所有人类蛋白质编码基因提供预先设计的gRNA。网址：https://cas13design.nygenome.org。
参考资料：
1.Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design, Nature Biotechnology (2020)，DOI：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0456-9
https://www.nature.com/articles/s41587-020-0456-9
2.New kind of CRISPR technology to target RNA, including RNA viruses like coronavirus
https://www.eurekalert.org/pub_releases/2020-03/nygc-nk031620.php
3. CRISPR System’s Optimized Guides Can Target RNA, Including Coronavirus RNA
https://www.genengnews.com/news/crispr-systems-optimized-guides-can-target-rna-including-coronavirus-rna/
4.NYGC Researchers Develop CRISPR-Based Screen to Target RNA Viruses Like SARS-CoV-2
https://www.genomeweb.com/gene-silencinggene-editing/nygc-researchers-develop-crispr-based-screen-target-rna-viruses-sars-cov#.XnK-RTMpj2c
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