circRARS与IGF2BP3协同调节m6A甲基化参与肾细胞癌的发生进展

研究背景

肾细胞癌(RCC) 是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，全球发病率呈上升趋势。透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是RCC最主要的病理亚型，其特点是迁移能力强，对放疗和化疗具有耐药性。大多数晚期RCC患者会在6-15个月内对舒尼替尼等靶向药物产生耐药性。因此，探索RCC进展的机制、推断有效的生物标记物以用于 RCC的早期检测和预后预测迫在眉睫。

文献来源

华中科技大学同济医学院附属协和医院章小平教授团队在期刊《Clinical and Translational Medicine》上发表题为“circRARS synergises with IGF2BP3 to regulate RNA methylation recognition to promote tumour progression in renal cell carcinoma”的研究论文，研究结果发现源自精氨酰-tRNA合成酶1(RARS1)2-4号外显子的circRNA hsa_circ_0001550(circRARS)与IGF2BP3的KH1-KH2结构域结合。IGF2BP3/circRARS通过m6A依赖性方式介导了CAPN15,CD44,HMGA2,TNRC6A和ZMIZ2的mRNA稳定性。阐明了IGF2BP3/circRARS复合物在RCC进展中的致癌功能，并为RCC患者提供了一个新的治疗靶点。

研究结果

研究人员对七项研究进行了荟萃分析，证实IGF2BP3是影响RCC患者预后的危险因素(图1A)。接着，在多个公共数据库中测定了TCGA-KIRC队列中IGF2BP3的表达，结果表明IGF2BP3 mRNA在RCC组织中的表达显著增高，并与预后相关(图1C,D)。再使用CRISPR-sgRNA或质粒载体来特异性调控IGF2BP3在RCC细胞系以及异种移植瘤模型中的表达，并验证IGF2BP3增加了RCC的恶性进展(图1E-I)。

图1 IGF2BP3是RCC的潜在生物标志物，并能促进RCC的进展

接下来，研究人员在RCC细胞系中发现了IGF2BP3对m6A修饰的识别能力，因为"GGAC"基序在RIP样本中大部分富集(图2A-B)。研究人员将RCC细胞的RIP-Seq数据与RCC组织的circRNA测序数据取交集。筛选出circRARS是RCC细胞中可能与IGF2BP3结合的circRNA(图2C-J)。

图2 IGF2BP3可识别N6-甲基腺苷(m6A)修饰位点并与circRARS结合

随后，研究人员通过截断质粒与体外结合实验验证了IGF2BP3与circRARS的特异性结合位点，位于IGF2BP3的KH1-KH2结构域(图3)。并发现IGF2BP3/circRARS复合体通过m6A的方式调控下游分子(CAPN15,CD44,HMGA2,TNRC6A和ZMIZ2)的RNA稳定性，并构建过表达circRARS RCC细胞(circRARS慢病毒购自Genomeditech)，通过一系列挽救实验证实了复合体的调控作用(图4-6)。最后，研究人员通过体内实验证实IGF2BP3/circRARS对于RCC进展的促进作用。

图3 circRARS通过其12-nt RNA序列与IGF2BP3的KH1-KH2结构域相互作用

图4 circRARS参与RCC分子机制图解

综上所述，IGF2BP3和circRARS通过KH1-KH2结构域和12-nt序列(GUCUUCCAGCAA)相互作用，增加了IGF2BP3对m6A的识别，从而增加了CAPN15, CD44, HMGA2, TNRC6A和ZMIZ2等靶基因的mRNA稳定性，促进了RCC的进展。IGF2BP3有望成为治疗RCC的新靶点。

本研究中所用的IGF2BP3、circRARSWT和M12过表达质粒、circRARS过表达慢病毒均由吉满生物提供。

文章来源：课题组供稿

原文引用："IGF2BP3 cDNA was purchased from Genomeditech (Shanghai) and cloned into p3 FLAG-CMV -10 vector to construct the overexpression plasmid. circRARS wild-type (circRARSWT) and circRARS-M12 plasmid were synthesised and purchased from Genomeditech (Shanghai). Truncations of IGF2BP3 were amplified with primers, as shown in Table S3, and were cloned into p3×FLAG-CMV-10 vector. Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen) was applied following the manufacturer’s protocols for transient transfection when RCC cells were at 50% confluence. Lentivirus (circRARS from Genomeditech)was added into RCC cells at 40% confluence. An amount of 5 μg/mL puromycin or 5 μg/mL blasticidin was used to screen stable cells."