正确认识支原体污染以及检测与防治

一．什么是支原体污染

支原体是一种大小仅为0.2~0.3 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。

二．支原体污染从哪来

细胞培养中有几种支原体污染与人、牛和猪有关。实验室的工作人员是口腔支原体、发酵支原体和人型支原体的主要来源。这三种支原体占细胞培养中支原体污染的一半以上，它们主要存在于人的口咽部。精氨酸支原体和无胆甾原体是另两类细胞培养中的支原体，它们来自胎牛血清和新生牛血清。胰酶如果是猪来源的，那么也可能存在猪鼻支原体。

在超净台中，用胰蛋白酶消化该污染的细胞后发现，活的支原体可从细胞培养瓶外的细胞计数板、移液器、废弃盘中被技术员分离出来。即使过了四至六天，活的支原体仍然可以存在于超净台表面，可被成功恢复。在超净台里，传代完被支原体污染的细胞后，再传代干净的不含支原体的细胞，结果仍然在6周后被检测出支原体阳性。这些结果表明，支原体的传播是多么的快速和容易！它也警告我们，要最大限度的避免支原体的污染，因为一瓶细胞发生污染，就会带来支原体传播的可能。

不恰当的消毒导致污染的另一个原因。高压锅或干热烤箱中堆积太多的物品造成加热不均，使一小部分耗材未得到消毒。灭菌循环时间过短是另一个消毒上犯的错误，特别是对于超过500ml的液体，或者是包含固体成分的溶液，或胶体物质如琼脂、淀粉等。为了实现无菌，灭菌材料的尺寸、质量、性质和体积必须始终考虑。

三．支原体污染怎么测

1.相差显微境检测：

将细胞按种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间；

2.荧光染色法：

荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理盐水漂洗。置于用生理盐水配浓度为50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点；

3.电镜检查：

用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜；

4.DNA分子条文检查或支原体培养等方法：

检出率高。但方法较为复杂；

5.PCR检测支原体污染：

PCR作为一种快速、灵敏、特异且简便的基因诊断技术已应用于科学研究和疾病的诊断。根据支原体基因组内的保守序列设计特异引物，对待检样品的核酸进行扩增，通过对扩增产物的大小分析作出诊断。PCR检测技术用于支原体污染的检测，周期短、灵敏度高、特异性好、操作简单且一次可检测大量样品。

四．支原体污染怎么防

1.收到新细胞进行支原体检测，将支原体检测阳性的细胞与其他细胞分开处理和培养；

2.在细胞培养过程中，要保证环境的干净，无菌。对生物安全柜，细胞培养箱定期消毒。实验器材照紫外，用75%酒精擦拭。实验耗材进行高压灭菌；

3.实验过程中需要的培养基，血清在使用前进行支原体检测；

4.实验室要定期打扫，每次使用细胞间要提前打开紫外线灯照射半小时以上。

五．支原体污染怎么治

对于非重要的细胞，如培养中的细胞、WCB的细胞等，将培养物与用过的培养基灭活后丢弃即可。对于较为重要的细胞，如来源珍贵或实验室中细胞保藏量较小等可以采用以下的方法。

1.用MRA处理：用支原体清除剂（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，作用浓度为 25μg/ml，两周可以清除支原体。

2.用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

3.药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

4.使用支原体清除培养基，每2-3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1-2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。