寡核苷酸不躺平分析方案
核苷酸的色谱分离方法主要使用三乙胺（TEA）作为离子对 基于带电量和疏水性的差异有效区分。对于长度大于40 mer及以上的寡核苷酸基本失去区分单核苷酸能力,该系统兼容LCMS联用，但只能使用负离子模式，TEA离子对系统下正电荷离子全部被抑制，但是其它大分子如蛋白质谱采集均使用正离子模式，而IP系统使用后要长时间清洗除掉TEA才能正常转换为正离子模式而不干扰正离子数据采集。寡核苷酸在HILCI色谱上可以达到媲美离子对反向色谱的分离度，HILIC-MS中质谱检测器正负离子下均能用于检测寡核苷酸，正负离子信号强度相当，克服了在负离子模式下无法检出阳离子杂质这一难点，无缝对接平台型质谱。
现如今，分离寡核苷酸的色谱方法都使用三乙胺（TEA）作为ion pair （IP）, TEA是一种强IP,能够基于带电量和疏水性的差异有效区分不同长度的寡核苷酸。对于长度大于40 mer的序列及以上的寡核苷酸基本失去区分单核苷酸能力。有易挥发，分子量小等优点，也可以兼容LCMS联用，但只能使用负离子模式。
寡核苷酸药物反义核酸、小干扰核酸、核酸适配体、小激活核酸、微小核酸，组成单体更多的是一些修饰核苷酸，如于硫代修饰，由于硫代后产生更多手性中心，峰展宽在色谱上加剧。后续的实验发现一种亲核性的氟化醇六氟异丙醇（HFIP），极性较强，与水和有机溶剂任意比例混合且热稳定性好，能消除非对应异构体的影响,与质谱兼容性好,分析物在该条件下离子化效率高，已成功运用于LCMS 联用分析寡核苷酸及其代谢产物。
能够高效分离寡核苷酸的流动相和液相基础参数如下
常见TEA\HFIP的流动相配置
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流动相A
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10% methanol, 90% aqueous, 14.3 mM Triethylamine (TEA), 385 mM Hexafluoroisopropanol (HFIP), pH 7.9
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流动相B
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25% methanol, 75% aqueous,14.3 mM Triethylamine (TEA),
385 mM Hexafluoroisopropanol (HFIP), pH 7.9
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C18
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0 to 100% B in 30 min
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UV260
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60 °C
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常见TEA\HFIP的分析寡核苷酸图谱
寡核苷酸IP-RPC MS联用分析 图谱
核苷酸样品一般为化学合成，API主组分纯度大于90%， API中杂质主要以N-1，N-2,deprtiin 为主，除了IP-RPC之外，离子交换色谱IEC也用于分析其纯度，综合以上两种方法评估其纯度，但是色谱分析核苷酸纯度分析受限分离条件，一些寡核苷酸药物研发的头部公司如Ionis/ Alnylam也积极将液质联用作为寡核苷酸质量控制的基本手段，主要基于IP-RPC-MS联用。
基于分子特点（磷酸基团）和流动相中主要正电荷离子三乙胺，IP-RPC-MS质谱检测主要以负离子模式采集为主，该色谱系统下正电荷离子全部被三乙胺抑制，但是其它大分子如蛋白质谱采集均使用正离子模式，而IP系统使用后要长时间清洗除掉TEA才能正常转换为正离子模式而不干扰正离子数据采集。
质谱友好的寡核苷酸LCMS分析方法来了
亲水性大分子的其它色谱分析方法是亲水层析色谱（HILCI），我们测试发现，寡核苷酸在HILCI色谱上分离较好，在流动相方面，使用HILIC法分离核苷酸与传统的离子对反相(IP-RPC)分离相比有四大优势：1)流动相配置简单成本降低10倍以上；2) 流动相环境友好无毒；3)流动相稳定性至少提升10倍；4)无需色谱柱老化操作，可节省色谱柱钝化时间，开箱即可直接使用。HILIC色谱上样量大于1.5ul会导致色谱峰不规则也限制大体积上样，但是核苷酸样品溶解性一般都较好，这个HILIC-MS的上样量缺陷不会影响到实际样品的检测。
寡核苷酸HILIC-MS图谱
HILIC-MS 正负离子模式核苷酸图谱（左 负离子 1758.037 右正离子1760.041）
HILIC-MS分析核苷酸
结论
§ HILIC LC-MS可以替代传统的(IP-RPC) 分析寡核苷酸,其使用低毒性、成本低，可及性更高的流动相，兼容正负离子LC-MS采集，无缝对接常用质谱平台，稳定性更佳。
§ 寡核苷酸分析不躺平
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