小奕说药 │ 产品和工艺开发生命周期中HCP分析方法开发策略
生物制品中HCP残留含量通常被认为是产品的关键质量属性 (CQA)，是工艺稳健性监测的重要评价指标，也是产品的重要质控指标。
前言
生物制品中来自生产细胞系自身的蛋白成分被称为宿主细胞蛋白(Host cell Protein，HCP)。HCP组成复杂，既包含细胞分泌蛋白，也包括结构蛋白。由于种类繁多，这些蛋白的理化性质，如等电点、疏水性、相对分子质量等往往具有明显差异。HCP可能影响产品使用的质量，例如：
1
可能会引起病人的免疫应答或过敏性反应；
2
可以引发生物制品的聚集或片段化；
3
促进聚山梨酯的降解，产生含有降解产物的可见异物。
因此生物制品中HCP残留含量通常被认为是产品的关键质量属性 (CQA)，是工艺稳健性监测的重要评价指标，也是产品的重要质控指标。
法规
在美国、欧盟以及各国法规中，均将HCP定义为工艺相关杂质。相关指南指出，应通过使用适当的、受控的制造工艺将其水平降至最低。ICH Q6B指出，生物制品制造商应评估可能存在的杂质，并根据临床前数据和临床经验制定杂质的质量标准。在最终产品的残留量限值中，中美的推荐限度值均在0.01%以下。
HCP ELISA分析方法
酶联免疫吸附试验（ELISA）是各国药典推荐的在生物制品中检测残留HCP的方法，该方法具有操作简便、快速、高通量等特点。在USP<1132>和EP<2.6.34>中，从抗原抗体制备、方法开发、抗体表征和方法验证等多方面对宿主细胞蛋白检测方法进行了详细的表述。
# 3.1 开发周期
常见的HCP ELISA分析方法开发计划，应根据项目所处的不同阶段而定。在产品开发时选择商品化HCP试剂盒，该分析方法通常可使用至临床二期（图1A）。临床三期及以后，应优选平台工艺HCP方法或上游工艺专属HCP方法。如果希望将商业化试剂盒应用于临床三期和上市后，则应充分证明试剂盒中主要试剂（如标准品、抗体等）适用于本工艺的HCP检测。考虑到试剂盒来自外部供应商，生物制品生产方对其控制较少，当关键试剂（如抗体）更换时，应当证明更换前后的方法一致性。
平台工艺HCP方法是指使用公司特定的宿主细胞株，按照上游平台工艺生产的HCP标准品和对应抗体所开发的检测方法。当一个项目在上游条件相似时可用相同方法进行HCP检测。图1B表明，如果在产品开发时已有基于平台工艺的HCP方法，则此方法可用于产品开发的所有阶段。如果细胞培养工艺与平台工艺发生显著变化，并且可能引入显著不同的HCP群体，则在临床三期/工艺验证之前需要切换到专属HCP方法。
A：在产品开发时选择商业化试剂盒
B：在产品开发时选择平台HCP分析方法
# 3.2 HCP抗原制备
3.2.1. 空载细胞培养
使用空载质粒转染的生产细胞系,在接近于生产工艺的细胞培养条件下生成HCP。通常使用细胞池而不是单克隆培养的好处是更多的变异性可以产生更多的HCP。
由于细胞活率、代谢和密度的变化都可能改变抗原的HCP谱，因此可以略微更改细胞培养来产生不同的HCP组合（例如，允许发酵时间更长、人为改变培养条件及降低细胞存活率等），以获得更宽的HCP谱。
HCP抗原可以从代表性的小规模、中试规模或生产规模中产生。中试或生产规模可以最好地模拟实际工艺。然而，如果仅应用一次大规模生产，可能无法反映细胞培养过程中的正常变化；相反，可以合并几个小规模生产，以更好地反映细胞培养过程不同引起的变异性。
3.2.2. HCP收获
HCP抗原可以从细胞裂解物、HCCF或两者的混合物中制备，如图2所示。如果抗原从HCCF制备，则可以延迟收获细胞，以允许更多细胞裂解并释放HCP，从而拓宽HCP谱。上游发酵工艺结束后，对所得HCP抗原进行最小程度的处理，以减少HCP的损失。通常选择与实际下游生产工艺相同或相似的HCCF步骤去细胞碎片，然后通过超滤/渗滤处理HCCF，置换缓冲液（例如PBS或HEPE）并浓缩。应尽量减少过滤滤膜对HCP的损失，例如使用10 kDa或更小分子量截留的滤膜。
图 2. USP<1132> 哺乳动物HCP抗原制备的典型过程
3.2.3. HCP质量分析
在动物免疫前应对HCP质量进行分析：
1
制备抗原的总量；
2
免疫测定或质谱分析等方法确认HCP抗原无任何产品污染；
3
通过1-D或2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳确定存在尽可能多的HCP蛋白。
HCP抗原同时也作为标准品使用，因此还要确保：
1
生产量应足够大，以提供多年（通常为10-20年）库存；
2
抗原制备过程应详细记录，以便于后期再生产时的回溯；
3
HCP抗原组成也应足够全面，以耐受产品生命周期内的工艺制造变化；
4
HCP标准品应进行稳定性监测，避免发生降解。
3.2.4. 抗HCP抗体的制备
由于制备的抗HCP抗体使用期限可能较长（例如产品或平台的预期生命周期较长），因此所制备的抗体应尽可能多。由于CHO为哺乳动物细胞，因此使用在系统发育树上离哺乳动物更远的物种（如鸡）有助于产生针对哺乳动物保守蛋白的抗体，有助于提高抗体覆盖率。在免疫接种之前，应确认动物是否对产品药物存在预先免疫抗体，应排除反应阳性的动物。
每只动物可进行多次增强免疫，以产生高滴度、高亲和力抗体。低分子量HCP抗原往往免疫原性差，也可单独收集低分子量HCP抗原，然后实行不同的免疫策略以增强免疫效果。
在合并抗血清前应对每个个体的血清进行滴度或Western blot分析，以筛选和去除低滴度、仅对部分HCP具有免疫反应以及非特异性结合的抗体。最终获得的抗体库也应证明HCP的覆盖率与专属性。
图 3. USP<1132> 不同纯化方法的优缺点
# 3.3 HCP抗体的覆盖率研究
覆盖率评估方法有两种：二维电泳结合蛋白质免疫印迹（2-D Western blot）或免疫亲和捕获。USP<1132>对抗体覆盖率评估的2种方法进行了对比（图 4）。
图 4. 二维电泳结合蛋白质免疫印迹与免疫亲和二维电泳方法比较
3.3.1. 2-D Western blot
使用两块同样的胶对同一样品进行二维电泳，其中一块进行Western blot显色，另一块用银染/荧光染色；再用软件匹配分析两块胶中的蛋白质点，计算覆盖率水平（图 5）。该方法操作较为简便，但是重复性差、数据比对分析困难；且方法中HCP处于变性条件下，与ELISA检测中的HCP的天然状态不同（图 6）。
图 5. 2-D Western blot覆盖率分析流程图
图 6. USP<1132>覆盖率对比图示
左图：CHO HCP的2-D SDS-PAGE荧光染料染色
右图：与左图相同样品的Western blot分析
3.3.2. 免疫亲和二维电泳
免疫亲和二维电泳是基于免疫层析柱和二维电泳的方法。首先将HCP抗体偶联到层析填料上，然后上样HCP样品，过程中HCP抗体可捕获识别的HCP，而未识别的HCP则会流穿，最后洗脱富集HCP。分别将捕获前和捕获后HCP进行二维电泳银染分析，计算抗体的覆盖率（图 7）。
图 7. 免疫亲和二维电泳流程图
3.3.3. 免疫亲和-液相质谱（LC-MS/MS）分析
在免疫亲和的基础上，也可使用LC-MS/MS进行覆盖率分析，并且可以定量分析HCP。LC-MS/MS方法有几个优点：
1
可以在产品开发的早期鉴定潜在的高风险HCP（图8）；
2
可以确定单个HCP的相对水平。但由于最终产品中的单个HCP水平非常低，对此方法的灵敏度提出了非常高的挑战。
图 8. 一些潜在的高风险HCP
HCP ELISA分析方法验证
由于HCP抗原和对应的抗体均有上千种，且HCP种类和数量随纯化步骤而减少，这对HCP 免疫分析方法的验证提出了挑战。对于中间过程样品的验证，重点是方法准确度（加标回收率）、稀释线性和精密度。针对最终产品应从准确度、精密度、稀释线性、专属性、定量限等多方面进行考察。下面对ELISA方法验证中需要有针对性考虑的问题进行讨论。
# 4.1 定量限
ELISA定量限往往能做到ng/mL水平。首先向连续稀释的DS的溶液中添加10 ng/mL的HCP标准品。加标回收率可设为70%-130%（定量限处的加标回收率可设为50%-200%），计算满足要求的DS最小的稀释倍数。第二步，在最小稀释倍数下加不同浓度的HCP标准品，回收率应为70%-130%（定量限处的加标回收率可设为50%-150%），符合上述要求的最低浓度即为定量限。结果通常需满足由不同人员、不同天开展的至少三次实验均合格。
# 4.2 样本稀释线性
在HCP免疫测定中，由于包被在96孔板中的抗体数量一定，部分HCP含量可能会超过HCP抗体的量，在HCP抗体饱和的情况下，数据会失真；且免洗ELISA检测方法在高浓度HCP时，会存在Hook效应。因此在反应中HCP的量应低于抗体的量。某些情况下，方法灵敏度有限，即使样品连续稀释到定量限时也未观察到线性。在这种情况下，应报告验证范围内的最高HCP值。稀释结果的非线性并不罕见，一般认为是抗体数量不足，但也有其他潜在原因，例如抗体与产品的反应或基质干扰、存在非特异性抗体以及产品中存在HCP聚集等。
其他常用的HCP检测、定量和表征分析方法
HCP可用多种方法进行检测。除了最常见的ELISA外，其他常用的电泳方法有1-D SDS-PAGE、2-D SDS-PAGE以及CE-SDS等；常用的免疫印迹方法有1-D/2-D Western blot；色谱方法有反相色谱法和蛋白组学方法。
随着对产品中HCP种类的认识逐渐丰富，可以进行特定的蛋白质风险评估，并在必要时对特定HCP杂质进行检测。例如，开发定量HPLC-MS/MS方法，对特定HCP的肽段进行定量分析。
讨论
由于HCP的异质性，并非每种HCP在动物中都能产生抗体，高免疫原性的HCP所产生的抗体较多，通常在ELISA信号中占主导地位，而低免疫原性的HCP没有足够的抗体来识别它们。因此HCP检测读数为所有HCP的“免疫加权”。尽管如此， ELISA法能够测定最为广谱的HCP，是行业内最常用的HCP检测方法。作为补充，传统的HCP检测方法（例如1-D/2-D SDS-PAGE）仍然是HCP表征的有用工具。由于HCP检测的复杂性，需要根据产品生命周期选择合适的检测方法，开发者应进行充足的表征研究，进行必要的方法验证，满足监管方要求，确保患者的安全。
参考文献
[1] USP<1132>, “Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals”.
[2] EP 2.6.34, “HOST-CELL PROTEIN ASSAYS”.
[3] ICH Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products
[4] Wang X, Host cell proteins in biologics development: Identification, quantitation and risk assessment. Biotechnology and Bioengineering. 2009; 103:446–458. doi: 10.1002/bit.22304.
[5] Jones M, “High-risk” host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 2021;118:2870–2885. doi: 10.1002/bit.27808.
[6] Dixit N, Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles. J Pharm Sci (2016) 105:1657–66. doi: 10.1016/j.xphs.2016.02.029
[7] 崔新玲. 基因工程药物宿主细胞蛋白的研究进展[J]. 药物分析杂志, 2019(9):9.
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