基因与细胞治疗领域的病毒载体生产用细胞株的开发
基因治疗被认为是许多严重的和危及生命的疾病最有效和唯一的治疗手段，得到越来越多人的关注。同时，基因治疗的适应症正从罕见/极罕见疾病向更常见疾病发生转变，患者数量和综合疗法越来越多。因而，大规模的基因治疗病毒载体生产是行业的迫切需求。
2020年，FDA更新了关于基因治疗临床试验申请(INDs)的化学、制造和控制指导原则，内容包含稳转细胞株开发及细胞克隆性确证等。文件指出，细胞库（Cell bank）的稳定性及纯度是一个需要考虑的重要方面（https://www.fda.gov）。非单克隆来源的细胞群中，其细胞异质性相对较高，产量低的细胞系往往与高产细胞群体竞争，导致高产细胞个体占比越来越少，最终随着传代次数的增加，导致细胞库或工作库的质量下降，因此，通过单克隆细胞筛选是提高病毒载体产量及质量的重要步骤。单克隆源性的确证是一种控制细胞种群降低其异质性的方法，通过防止异种细胞群体的产生，来保障未来生产出的病毒产品的质量不受影响。
CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）针对 ELEVECTA® AAV包装细胞系的研究数据显示，通过单克隆筛选出的细胞株其AAV产量要比非单克隆细胞来源的高10倍左右（https://cevec.com）。
张瑰宜博士在“生物药生产用细胞株构建和筛选策略”研讨会上分享了她们使用Cytena 的单细胞打印机SCP的感受，其以专利的喷墨式打印技术温和而高效的分选单细胞，简化筛选工作流程，极大的提高了单克隆有效率，获得了稳定性高及一致性好的单克隆，用于后续的AAV生产，大大的提高了AAV产量。
英国著名的葛兰素史克（GlaxoSmithKline，GSK）药物研究中心报告了一种如何快速获得稳转的293T细胞，生成慢病毒载体的方法：将编码所有慢病毒载体成分的单个 DNA 结构体稳转入293T细胞，单细胞打印机进行单克隆筛选，获取遗传学和功能稳定的适应悬浮培养的生产用293细胞系。由此产生的悬浮细胞系可生产出与瞬时转染一样高滴度的病毒，可以在一次性搅拌罐生物反应器中轻松放大，并且在后续细胞培养中遗传和功能稳定。此方法将降低慢病毒载体的大规模生产成本，提升慢病毒载体在细胞治疗中的应用价值。（Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.）
在基因编辑领域，Stephan Riesenberg等学者进行细胞克隆基因型和靶基因拷贝数分析时使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供体电穿孔在 FRMD7 基因中编辑 409-B2 hiPSC，分别用（不用）2 M M3814 处理细胞 3 天后使用单细胞打印机(Cytena)对细胞进行单克隆化用于后续分析。文章中HEK293 和 K562 细胞的单克隆化也是通过使用单细胞打印机分选单细胞来获得的。（Stephan R , Manjusha C , Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.）
Gross等采用f.sight™单细胞打印机，通过GFP报告基因，用于选择和克隆CRISPR/Cas9编辑以敲除RANKL蛋白的间充质干细胞(MSC)，以进一步增强MSCs在再生医学中的治疗能力。
[1] 提升高产细胞株筛选效率，助力基因治疗、抗体药物等工艺开发——单细胞打印机（附案例分享）
[2] 简化CRISPR基因编辑的干细胞的工作流程，提高单克隆效率
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