小奕说药 | 高通量纯度分析方法加速工艺和产品开发
奕安济世生物药业理化分析平台隶属于工艺和产品开发部的分析科学部，承担理化分析方法的开发、验证、转移、开发中的技术问题解决、样品检测及相关平台管理等工作。
理化分析平台配备了多台Agilent和Waters高效或超高效液相色谱仪、Sciex毛细管电泳仪、Protein Simple全柱成像等电聚焦电泳仪、Agilent毛细管芯片电泳仪、Thermo紫外分光光度计等大型精密分析仪器；平台通过Empower 3网络版色谱数据管理系统（CDS）管理色谱类数据的采集，并建立了完善的色谱/电泳类数据的处理和备份流程。
纯度类（分子大小异质性、电荷异质性等）质量属性在抗体和融合蛋白类药物的工艺和产品开发过程中关注度较高，对这类分析方法通常存在开发周期短、检测通量高、方法精密度好和耐用性高等要求，为应对这些挑战，理化分析平台建立了适用性广、快速、可靠和精密的方法以支持工艺及产品开发工作，并通过不断迭代平台技术以适应新的要求。
重组蛋白类生物大分子如单抗、双抗或Fc融合蛋白等可能会因细胞培养、收获、纯化、存储期间的各种因素而导致蛋白聚集。聚集体对产品质量、有效性以及安全性有潜在的负面影响。
分子排阻色谱 (SEC) 是一种在研究、开发和生产生物治疗性蛋白质的过程中用于分析聚集体的强大技术。传统的基于HPLC方法的SEC一般需要20~30分钟完成一个样品的分析，为满足工艺和产品开发的高通量检测需求，奕安济世理化分析平台开发了基于UPLC的SEC快速方法，该方法在5分钟内即可完成一个样品的分析。与传统SEC-HPLC相比，SEC-UPLC具有分辨率更高、分析时间更短、更节省样品和溶剂等优点，同时聚集体分析结果与SEC-HPLC具有较高的可比性，可以较短的时间和较低的综合成本完成分析任务。
奕安济世生物药业理化分析平台筛选了三款主流的商业化SEC-UPLC色谱柱，并通过对多个单抗、双抗和融合蛋白等蛋白类分子进行了广泛的平台化和长时间、高样本数测试考察，确立了平台化的SEC-UPLC分析方法，且该方法和常规的SEC-HPLC色谱柱分析方法具有聚集体数据可比的分析性能，但大大节省了分析时间、样品用量，为工艺和产品开发的聚集体检测支持提供了有力保障。
图2汇总了不同类型样品在SEC-HPLC与SEC-UPLC上检测的结果（其中样品序号01-09为下游工艺中间样品，10-11为原液，12-13为制剂5℃/25℃稳定性样品）。由图可见，对于工艺开发中的各类型样品，两种分析方法的聚集体定量数据非常接近。
单克隆抗体的片段化是一个关键的质量属性，需要通过持续监测来评估抗体的纯度和完整性。在细胞培养、收获、纯化、存储过程中，均可能导致蛋白碎片的产生。目前CGE-SDS方法已经成为生物制药行业中蛋白质药物纯度（分子大小异质性）的片段分析首选方法，贯穿了培养基优化、克隆筛选、细胞培养、处方研究和纯化过程监测等多个关键环节。
传统的基于毛细管分离长度为20 cm的高分辨CGE-SDS方法，一般需要约50~60分钟完成一个样品的分析。为满足工艺和产品开发的快速检测需求，奕安济世理化分析平台开发了基于毛细管分离长度为10 cm的快速CGE-SDS方法，该方法可提高约40%的检测通量，每一个样品的检测时间可节省15-20min。快速CGE-SDS方法在方法稳定性和提高检测通量方面更有优势，并且其图谱和数据与高分辨率的CGE-SDS方法高度可比，详见图3和图4。
图3 高分辨率与快速CGE-SDS方法检测同一样品的叠图结果对比
图4 高分辨率与快速的CGE-SDS（非还原）检测结果对比
奕安济世理化分析平台还基于微流控芯片技术（CE-Chip）开发了平台化的高通量CGE-SDS片段分析方法，利用其高通量的分析优势（运行时间约1分钟/样品），应用于生物药的早期发现和开发的片段分析。该技术是基于微流控技术，在玻璃芯片上蚀刻若干微米级通道，构建“微型实验室”，样品从上样管道进入芯片，在电场或压力作用下，进入分离管道。当给芯片加电压时，样品在分离管道内进行毛细管电泳，由于分子量大小不同从而被分离开并到达监测点。同时，凝胶--染料基质中的荧光染料会嵌入样品中，通过激光激发荧光发光，使其被仪器检测到，仪器收集荧光信号强度并自动处理数据，完成芯片上的自动化分析。图5是该方法分析样品得到的图谱结果，在提高分析速度的同时也保证了一定的分离度，相较于常规毛细管电泳法的分析通量，其优势在分子早期筛选阶段的片段分析方面尤为明显。
图5 微流控芯片CGE-SDS（非还原）方法的图谱结果
单克隆抗体在生产及存储过程中会发生复杂的翻译后修饰，如氧化、脱酰胺、糖基化、C末端赖氨酸截除、N末端焦谷氨酸化等，造成抗体在电荷分布方面高度的异质性。电荷异质性对抗体药物的活性、免疫原性、药代动力学等均有潜在影响，是工艺和产品开发中需要高度关注的质量属性。适用于单克隆抗体电荷异质性的分析方法有多种，包括离子交换色谱法(IEX)、全柱成像毛细管等电聚焦电泳法（icIEF）、毛细管等电聚焦法（cIEF）、毛细管区带电泳法（CZE）等，其中离子交换色谱法由于具有灵敏的稳定性指示能力、分离度高、精密度好、专属性强、易于峰组分收集以及检测成本低等诸多优点，在单克隆抗体药物的电荷异质体分析中被广泛应用。奕安济世生物药业理化分析平台建立了多种方案的IEX开发和分析平台技术以及平台化的icIEF分析方法。
IEX通常采用盐梯度、pH梯度或盐介导的pH梯度三种洗脱模式。传统的IEX方法一般需要40-60 min完成一个样品分析，为满足工艺和产品开发的高通量检测需求，奕安济世理化分析平台开发了IEX短柱（5cm）快速分析方法，该方法在15分钟内即可完成一个样品的分析。与常规的IEX放行方法相比，虽然分离度有一定损失，但可大大缩短样品分析时间并节省溶剂，且检测结果与常规的IEX放行方法具有良好可比性，可满足特定研发样品的检测需求。
常规IEX放行方法和短柱IEX快速方法对比参数见表格1，图6和图7是两者的图谱比较。通过图谱和数据对比可知，两种IEX方法峰面积百分比和峰数目均具有良好的可比性。
表格 1常规IEX放行方法和短柱IEX快速方法对比案例分析
除IEX外，icIEF 同样被广泛应用于电荷异质性的分析。与IEX不同，它只根据蛋白净电荷差异进行分离，而IEX除了总电荷差异外，电荷的表面分布、蛋白几何结构和疏水特性等因素也会影响蛋白与色谱柱填料的相互作用，从而综合影响电荷异质性的分离检测。因此，对于部分重组蛋白质产品，尤其是糖基化复杂的蛋白，icIEF可以大大缩短方法开发时间，且方法有较好的耐用性。另外，icIEF只需10~15分钟就能完成测定，同时可以得到等电点信息，且准确度和分辨率均具有明显优势。在不同的项目中考虑不同分子的特性，将icIEF作为IEX的正交分析方法，并选取适当方法用于研发检测、产品放行和稳定性测试，是奕安济世理化分析平台电荷异质性分析的总体策略。
奕安济世生物药业理化分析平台建立了适用于大多数蛋白类分子的icIEF分析方法，并通过对多种不同的单抗、双抗及融合蛋白样品对该平台方法的广泛适用性进行了验证，结果显示该方法分离度高，精密度、准确度和耐用性好，且具有良好的稳定性指示能力，适用于多种类型蛋白的电荷异质性分析。
图8对比了某糖基化复杂的同一样品分别用icIEF和IEX检测的结果。结果表明，由于该分子具有非常复杂的糖基化电荷变异体，IEX色谱峰分离度差，icIEF检测图谱各个峰的分离度较好，其对不同电荷异构体的分离度较IEX具有较为明显的优势。
综上所述，奕安济世生物药业建立的平台化快速纯度分析方法具有适用性较广、分析时间更短、综合成本更低且与放行分析方法数据可比的特点，在工艺开发样品检测中产生了良好的降本增效效应，有力地促进和加速了产品的开发。
奕安济世具有丰富的细胞系开发、工艺开发、临床样品生产及放行、IND/BLA申报的全流程经验。奕安济世在杭州拥有工艺开发中心及 符合cGMP 标准的原液及成品生产车间，通过技术的不断创新及稳定的连续化生产工艺，可极大缩短工艺开发进程和降低生产成本，为生物药创新合作伙伴提供优质、可靠、快速的 CDMO服务。
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