细胞培养生物工艺

哺乳动物细胞在生产复杂蛋白质方面具有巨大的生物合成潜力，这些蛋白质需要微生物细胞无法进行的翻译后修饰。三十年来，我们在利用这种合成潜力方面取得了极大的成功，并培育了一个非常庞大的生物制药行业。在本文中，我们将重点介绍细胞培养工艺技术方面的一些创新和革新，这些创新和革新促进了基于哺乳动物细胞的蛋白质治疗药物的持续成功，从工艺技术和产品质量管理，到优化的细胞系以及使用组学工具和系统方法（图1）。随着下一代细胞和基因治疗产品的出现，这些新的分析测试和系统方法将有助于塑造这些产品的制造过程，以提高生产力和产品质量。

典型的细胞培养工艺开始于通过一系列尺寸不断增加的反应器（也称为种子扩增链）在悬浮培养中生长和扩增细胞，直到产生足够数量的细胞，来接种生产反应器。该过程与微生物发酵非常相似，只是需要更长的时间以及更复杂的培养基，才能满足哺乳动物细胞的营养需求；生产反应器的运行可能会持续十天以上，而不是典型微生物发酵的一两天。在生产过程中，对溶氧(DO)、pH 和温度等关键工艺参数进行在线监测，而对葡萄糖、乳酸和 CO2 等关键代谢物的浓度进行离线检测。

近三十年来，大多数细胞培养工艺采用补料分批模式，在细胞培养过程中加入浓缩的营养补液，延长生产周期，使细胞密度达到较高水平，使产物积累。在过去的二十年中，增强的工艺技术允许获得更高的细胞密度和产物浓度。对于IgG 等产品，滴度可能在 10 g/L 范围左右，当抗体产品在 1990 年代中期开始起飞时，这一水平是无法想象的。连续细胞培养，几乎总是与使用内置或外置的细胞截留装置相结合，以提高细胞密度和生产力，多年来一直被归类在容易降解或生产水平非常低的产品的解决方案当中。在过去的十年中，人们越来越关注更小的一次性反应器和连续培养，而不是使用大型不锈钢罐进行补料分批培养。

采用摇摆袋子或其它类型容器形式的一次性生物反应器主要用于种子培养制备或小规模生产。随着蛋白质产品及其工艺技术的成熟，降低商品成本的愿望也随之增加。与传统上基于不锈钢反应器的设施相比，使用一次性反应器的生产工厂需要更少的资本支出，并且建造时间更短。它还可以提高生产操作的灵活性。然而，基于塑料结构的一次性搅拌罐反应器的可放大性会有一定的限制。为了提高一次性生物反应器的生产率，解决方案是以连续模式运行。降低的培养基蛋白质含量和降低的膜污染，以及具有交替式切向流(ATF) 的细胞截留中空纤维装置的成功，也促进了连续操作的采用。

已经有小组进行了研究，以模拟通过ATF 中空纤维系统的流体动力学。评估了ATF 装置和流体传输管路中的细胞滞留时间对可能的缺氧和对细胞的流体动力学损伤（通过估计能量耗散）的影响。使用计算流体动力学(CFD) 模型来评估操作条件对通过 ATF 中空纤维的通量的影响，并显示跨膜存在反向流动，这种现象被称为“椋鸟巡回”流动，被认为可以减少结垢。

连续培养可以在稳定状态下运行，从而使细胞的生理状态随时间保持恒定，并可能提供更一致的产品质量。与批次培养中的最大生长速率相比，大多数连续细胞培养工艺的生长速率相对较慢。在低生长速率下，可以使用较小的细胞废弃速率来保持稳定运行。此外，较慢的生长速率有助于切换到低糖酵解通量状态。一种改善灌流培养的策略是通过降低温度或添加生长抑制性戊酸来减缓细胞生长，从而减少特异性乳酸生产、提高特异性氨生产，同时提高单克隆抗体(mAb) 生产力。

为了在灌流培养中保持恒定的细胞密度，一些人采用了经典的恒浊（turbidostat）策略，通过调整稀释率、补料营养浓度或细胞废弃率来保持细胞密度恒定。测量活细胞密度的在线电容探针通常用作控制手段。尽管如此，观察到细胞密度以及特异性速率的各种生长和代谢指标在很大范围内波动并不罕见。细胞代谢中变构调节的复杂性允许在给定的一组营养补液和稀释率操作条件下存在多种代谢状态。在这样的复杂系统中，系统达到的稳态受初始条件和培养趋势的影响。操纵启动培养条件可能会导致不同的稳定状态。然而，关于灌流培养动力学和控制策略的系统性讨论尚不多见。

近三十年来，细胞培养生物反应器中使用的在线传感器仅限于用于测量pH、DO 和温度的传统传感器。化学分析仅限于离线检测或使用自动取样装置的近线检测，其通常仅限于更复杂的研究型反应器。近来，拉曼光谱已成为一种常用的在线传感器，用于监测各种营养水平，这基于其早期在细胞培养工艺中的应用。由在线拉曼光谱传感器获取的光谱通常经过多元分析或化学计量，以使用偏最小二乘法确定目的变量的浓度。在过去的几年里，它已被用于监测葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺和氨的浓度。定量检测的浓度范围大多在1mM范围或更高。研究已经表明，即使使用相对较少的数据集，也可以建立在线葡萄糖测量模型，并开发过程分析技术(PAT) 控制器，以将葡萄糖保持在低水平 (2 g/L)，同时降低产物蛋白质中的糖基化水平（即葡萄糖分子与蛋白质中氨基的共价结合）。

除了糖基化之外，还必须控制其它类型结构性异构体的丰度水平，包括糖基化、二硫键加扰和产物蛋白质的各种蛋白水解切割。与糖基化一样，二硫键断裂和重组发生在产物蛋白质分子分泌到培养基后。这发生在溶氧水平低或存在高水平还原剂的产品回收阶段。据报道，深层过滤中剪切损伤导致的细胞裂解会导致酶和NADPH 的释放，从而导致二硫键断裂。这可以通过在储存袋中保持较高的溶氧水平来缓解，从而降低澄清收获中的还原环境。如在生产IgG4-Fc 融合蛋白的细胞系中所见，宿主细胞酶的蛋白水解切割可能导致生产力降低以及最终产物中降解片段的污染。比较具有不同蛋白水解程度的细胞系的转录组可确定弗林蛋白酶是主要的作用蛋白酶，随后在培养物中使用弗林蛋白酶抑制剂可减少融合蛋白的降解。

分析技术的进步现在能够对蛋白酶消解的促红细胞生成素（EPO）-Fc 融合蛋白的单个糖基化肽上的N-聚糖进行表征。研究揭示了不同糖基化位点的不同聚糖谱，尤其是唾液酸和岩藻糖的丰度水平。此外，不同的培养基和不同的培养持续时间会导致空间分布的变化。聚糖异质性结构分辨率的提高将扩展我们对它们的生物学和临床意义的理解，并增强我们将它们控制在可接受范围内的能力。空间聚糖分布也证明了通过细胞工程或控制培养条件来操纵糖基化谱的复杂性。在同一项研究中，O-聚糖的组成也随着时间和不同的培养基而发生变化。在 EPO-Fc 上发现的少量 O-聚糖与中国仓鼠卵巢(CHO) 细胞中预测的有限 O-糖基化网络一致。

产物中的宿主细胞蛋白 (HCP) 水平也必须控制在可接受的监管水平。残留 HCP 的一些酶活性可能会在长期储存过程中改变产品特性。蛋白质组学被用于识别污染性 HCP，促进它们从产品中的层析去除或敲除相关的基因，以缓解问题。除 HCP 外，存在于常用宿主细胞系基因组中的内源性逆转录病毒 (ERV) 在生物制造中具有安全性和监管问题。ERV 具有产生传染性病毒颗粒的“神秘”潜力。它们还可以转移、激活或灭活宿主细胞基因并改变宿主细胞。通过对Vero 细胞中 ERV整合位点的鉴定，表明细胞系建立后发生逆向易位的可能性非常低。