miRNA sponege 构建
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- 2022-12-14 15:59:12
北京欧林格生物科技有限公司
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miRNA sponge
相对于常规基因来讲miRNA的功能丧失（loss-of-function）研究是难题，常用的RNAi技术在这里却不好用。成熟的miRNA与siRNA不相容，因为它们两者都能进入RISC复合物；pre-miRNA是茎环结构的，siRNA无从下手；pri-miRNA貌似是siRNA最容易靶定的，但一个是细胞核，一个在细胞质。
2007年，麻省理工大学的Phillip Sharp及他的同事，开发出一种长期抑miRNA基因的高效方法,他们称之为miRNA海绵（miRNA sponge）。miRNA海绵是一条mRNA，其3’ 非翻译区（UTR）包含若干个miRNA靶定位点（如下图）。更重要的是，这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。这样，抑制剂mRNA就不会被降解，而与RISC复合物稳定结合，让它远离天然的mRNA靶点。
经研究证实，这些miRNA海绵是高效的miRNA抑制剂，其效力与反义寡核苷酸相当。由于miRNA与靶点的相互作用是依赖种子区域（seed region，miRNA的第2-8位），这样miRNA海绵对家族中亲缘关系接近的所有miRNA都有效，即特异性不高，这也有利有弊。制备某个家族缺陷的转基因小鼠变得相当容易。但如果你想要了解某个miRNA的特定功能，那就得将与之接近的miRNA全部去除。
作者做了这样的验证实验：将miR-20和miR-20结合的位点构建到荧光素酶载体上，和miR-sponge表达质粒共转hela细胞，结果显示转染miR-sponge组的荧光素酶表达明显高于对照组。
miRNA海绵的应用很广。它可用于靶点预测的验证，也能分析miRNA的功能丧失表型。由于miRNA海绵是由表达质粒编码的，那么它也很容易推广到其它形式，譬如慢病毒、腺病毒或转基因，适合各种不同的细胞类型。Sharp还在研究中证实，在UTR上多加几个miRNA结合位点，能增加反义序列的量，从而提高海绵的效力。从原理上来说，miRNA海绵的CMV启动子也可以换成其它组织特异的启动子，让它们在果蝇、植物等模式生物中起作用。
我司常用miRNAsponge慢病毒表达载体如下：
参考文献：
1. Margaret S Ebert, et al. MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature Methods 4, 721 - 726 (2007)
1. Margaret S Ebert, et al. MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature Methods 4, 721 - 726 (2007)
