实验方案参考

一、设备和试剂准备

（一）仪器设备（肿瘤组织块）

超净工作台或者生物安全柜、水浴锅、一次性100mm培养皿1个、灭菌剪刀和镊子若干、灭菌100mL摇瓶、电动移液器、一次性15/50mL离心管若干、一次性50mL注射器及0.22μm过滤器若干、100mL无菌试剂瓶、离心机、一次性5ml巴氏吸管、75%酒精及其喷壶、0.4%台盼蓝及血球计数板、碎冰、泡沫盒。

（二）仪器设备（实体器官消化）

超净工作台或者生物安全柜、水浴锅、蠕动泵（LongerPump，YZ1515X）、手推式电动废液缸、一次性100mm培养皿1个、乳胶管（灭菌、长度168cm，规格充满14ml液体）、灭菌剪刀和镊子若干、灭菌动脉夹、灭菌止血钳、一次性输液针（黑色0.7*25）、电动移液器、一次性15/50mL离心管若干、一次性50mL注射器及0.22μm过滤器若干、100mL无菌试剂瓶、离心机、泡沫板、废液托盘、固定针头、一次性5ml巴氏吸管、75%酒精及其喷壶、0.4%台盼蓝及血球计数板、碎冰、泡沫盒、新鲜配置6%的戊巴比妥钠。

（三）试剂盒试剂耗材

表1 试剂盒清单

二、试剂准备（现用现配）

（一）灌注溶液A（LV-PHIK00201）工作液：无菌条件下，取100mL灌注溶液A至100mL无菌试剂瓶，补加1mL EGTA母液（LV-PHIK00109）、1mL抗生素（LV-PHIK00110），放于4℃备用。注意：理论上100mL灌注溶液A工作液足够预处理1-3g组织或器官，在熟练的情况下可进一步优化。

（二）灌注溶液B（LV-PHIK00202）工作液：无菌条件下，取100mL灌注溶液B，取一支精选胶原酶（LV-PHIK00108），利用约20mL灌注溶液B 充分溶解精选胶原酶，0.22µm过滤器（LV-PHIK00105）过滤，最后补加1mL抗生素（LV-PHIK00110），放于37℃备用。注意：理论上100mL灌注溶液B工作液足够消化1-3g组织或器官，在熟练的情况下可进一步优化。

三、肿瘤组织消化（以肝癌组织为例）

（一）样本放于100mm培养皿中，加入10mL冰冷的灌注溶液A工作液，用无菌剪刀镊子去除包膜、脂肪、淤血等，清洗3次。

（二）将肿瘤块转移至新的50mL离心管中，加入10ml冰冷的灌注溶液A工作液，将组织块剪成1mm大小的组织块，补加冰冷的灌注溶液A工作液至20mL，100xg离心5min，去上清，清洗3次。

（三）加入灌注溶液B工作液20mL（灌注溶液B（LV-PHIK00202）亦可），颠倒混匀，100xg离心5min，去上清（去除灌注溶液A工作液的EGTA）。

（四）加入灌注溶液B工作液20mL，颠倒混匀，转移至100mL摇瓶中，加入剩余灌注溶液B工作液，密封后置于37℃摇床，转速120rpm，消化0.5-2hours。

为避免过度消化造成细胞活率低，建议每15min观察摇瓶一次，直至80%组织块消失。

（五）取出摇瓶加入EDTA母液（LV-PHIK00109），加入量为1mL灌注溶液B工作液/10μL EDTA，终止消化五分钟。

（六）台盼蓝检测细胞活率，进一步细胞分类纯化。如细胞活率低于60%，可利用活细胞纯化液（LV-PHIK00104），推荐步骤如下：

1、50g，4℃离心5min，去上清；如纯化1-3g肿瘤组织细胞，在15mL离心管中利用10mL活细胞纯化液（LV-PHIK00104）重悬细胞，然后沿管壁向离心管小心地加入5ml细胞洗液（LV-PHIK00203）（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）。

2、800×g，4℃离心20min，降速加速度设置为1；离心后，吸取活细胞纯化液（LV-PHIK00104）和细胞洗液（LV-PHIK00203）之间浑浊带（活细胞层），转移到新的50mL离心管中，加入2倍体积的细胞洗液（LV-PHIK00203），上下轻轻颠倒混匀，100×g（可根据细胞类型进行调整），4℃离心5min。

3、台盼蓝检测细胞活率，并进一步进行下游步骤。

四、实体器官消化（以小鼠肝脏为例）

（一）用镊子夹起小鼠腹部表层皮肤，并从中间剪一小口后向两侧剪开直至暴露整个内层皮肤，将皮剪除；

（二）换新的无菌剪子与镊子，夹起腹部内层皮肤从中间剪一小口后向两侧剪开直至暴露整个腹腔，用固定针固定两侧皮肤以及内层皮肤，防止皮毛污染肝脏细胞；

（三）用镊子轻轻将胃及肠子往右翻开，暴露下腔静脉，打开蠕动泵（此时流速是1r/min），将注射针（链接灌注液，整个灌注装置已排除空气）插入下腔静脉，开始灌注，见肝脏有变白则立即剪断肝门静脉；将灌流速度缓慢加大到7-9mL/min，流速可以1-2ml/秒的速度递增（建议让助手调节流速）；并剪破心脏，用止血钳或者动脉夹夹住上腔静脉，此时夹住肝门静脉可见肝脏较易膨大并立起来，说明插入位置正确灌注成功。

（四）小鼠灌注溶液A工作液70ml，约6-8min；灌注溶液B工作液70ml，约6-8min。灌注溶液B工作液的灌注过程中，需将肝门静脉夹住5次，每次约2-5秒，使肝脏膨胀，肝内增加的压力有助于肝脏的消化，从而提高产率。

（五）灌注消化液直至肝脏失去弹性，用镊子按压肝脏，肝脏会形成明显压印，说明消化完成。

（六）将肝脏快速（1-2min内）从动物身上解离下来，转移到盛有10mL灌注溶液B工作液的培养皿中，将组织扯破，小心将细胞抖落；如消化充分，可及时加入足量细胞洗液。（此时所有涉及肝细胞处理的步骤必须使用无菌器材并且动作要轻柔，此时的肝细胞非常脆弱，并且易受剪切力的损伤）。加入足量预冷细胞洗液（总的细胞洗液体积为30ml），细胞悬液过70μm细胞筛（提前底部预湿）。

（七）50g，4℃，5min离心。预冷细胞洗液（约30ml/1-2只小鼠肝细胞）重悬细胞，轻轻吹散细胞，50g，4℃，5min离心，重复2次。

（八）预冷细胞洗液重悬细胞（约30ml/1-2只小鼠肝细胞），台盼蓝（台盼蓝：细胞=1:9）计数。

（九）细胞纯化：如果活力过低（低于80%），需要进行纯化处理。

1、50g，4℃离心5min，去上清；如纯化1只小鼠的肝细胞，在15mL离心管中利用5mL活细胞纯化液（LV-PHIK00104）重悬细胞，然后沿管壁向离心管小心地加入5ml细胞洗液（LV-PHIK00103）（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）。

2、800×g，4℃离心20min，降速加速度设置为1；离心后，吸取活细胞纯化液（LV-PHIK00104）和细胞洗液（LV-PHIK00103）之间浑浊带（活细胞层），转移到新的50mL离心管中，加入2倍体积的细胞洗液（LV-PHIK00103），上下轻轻颠倒混匀，50×g，4℃离心5min。

3、去掉上清并用小鼠铺板培养基（推荐LV-WEP006）重悬细胞，细胞计数，确定纯化效果。理论上细胞活力可达85%以上。