I 简介

立沃生物科技是一家专注于原代肝细胞冻存与再生的国家高新技术企业。我们的原代肝细胞分离自正规医院获取的人肝组织，所有材料来源清晰，病人或者家属知情同意。我们的细胞产品经过多种测试，复苏后细胞活力高、极化（分化）形态明显，可广泛应用于基础生命科学研究以及药物研发中。

II  试剂与材料

-人原代肝细胞

-复苏培养基（Cat#LV-Rec001）

-纯化培养基（如需要，随细胞赠送）              

-铺板培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEP001）

-维持培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEM001）

-胶原包被培养板（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-Coated）

-无菌15ml离心管

-宽口移液枪头（普通移液枪头剪去尖头，再灭菌使用）

-移液枪

-恒温水浴锅（37℃预热，请用温度计校准）

-冷冻水平离心机（带水平转子，可离心15ml离心管）

-生物安全柜

-37^oC/5%CO₂培养箱

III 悬浮细胞的复苏

• 生物安全柜中，将10ml复苏培养基加入到15ml离心管中，37℃恒温水浴锅预热20min，然后转移到生物安全柜中；
• 将冻存的肝细胞从冷藏位置迅速转移至37℃恒温水浴锅中，尽可能多的浸入37℃水中，顺时针水平摇动，但必须确保冻存管管盖保持在水面以上。
• 解冻冻存管约90 ~120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。
• 用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。
• 用宽口枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至含已预热的复苏培养基的离心管中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可吸取1ml复苏培养基清洗冻存管与枪头并将其混入离心管的培养基中），轻微上下颠倒离心管2-3次混匀。
• 用台盼蓝排除法测定肝细胞的活力、活细胞数。按照实验要求加入药物，测定药物代谢情况。
• 如细胞密度达不到要求或者担心冻存液对代谢酶活性有影响，可直接低速离心（离心对细胞活力有一定的影响），50*g，常温离心5min。去上清，用药物代谢专用培养基（客户自备）重悬，用台盼蓝排除法测定肝细胞的活力、活细胞数。按照实验要求加入药物，测定药物代谢情况。

IV 贴壁细胞的复苏

生物安全柜中，将10ml复苏培养基加入到15ml离心管中，37℃恒温水浴锅预热20min，然后转移到生物安全柜中；纯化培养基常温放置；铺板培养基37℃预热。

将冻存的肝细胞从冷藏位置迅速转移至37℃恒温水浴锅中。尽可能多的浸入37℃水中，顺时针旋转解冻，但必须确保冻存管管盖保持在水面以上。

解冻冻存管约90-120S，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。

用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。

用宽口枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至含有10ml预热的复苏培养基的15ml离心管中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可吸取1ml复苏培养基清洗冻存管与枪头并将其混入离心管的培养基中），轻微上下颠倒2-3次混匀。可以直接低速离心，50*g，常温离心5min。去上清，用4ml铺板培养基重悬，用台盼蓝排除法测定肝细胞的活力，若活力>70%，可直接铺板，反之则需进行纯化。

（如需要细胞纯化）低速离心（50*g，常温离心5min），去上清，用2ml纯化培养基（免费提供）重悬细胞，沿管壁向离心管小心地加入1ml铺板培养基（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）。800*g，4℃离心20min，降速加速度设置为1，离心后，吸取纯化培养基和铺板培养基之间浑浊带（活细胞层），转移到新的15mL离心管中，加入2倍体积的铺板培养基，上下颠倒混匀，50*g，常温离心5min，去上清并用4ml铺板培养基重悬细胞。

用台盼蓝排除法测定肝细胞的存活率和细胞总量，建议检测3次，求取平均值。

步骤6所得到的细胞，严格按照具体实验用途选择合适的处理方式。

1）细胞培养： 细胞悬液可直接铺板，按照以下密度接种到胶原包被培养板中，摇匀，置37^oC/5%CO₂培养箱中培养：

中密度培养：1.2~1.8*10⁵cells/cm²（平均1.5*10⁵cells/cm²），在37℃ / 5%CO₂培养箱中培养4-6小时，理论细胞融合度50-80%左右。

高密度培养：1.8~2.0*10⁵cells/cm²（平均1.9*10⁵cells/cm²），在37℃ / 5%CO₂培养箱中培养4-6小时，理论细胞融合度80-90%左右。

2）人鼠嵌合模型:请将步骤6所得细胞，进行低速离心（50*g，常温，5min），去上清，细胞沉淀物用PBS/生理盐水/培养基重悬，尽快进行细胞移植。

V 肝细胞维持及乙型肝炎病毒感染

• 贴壁培养4-6小时，细胞已经完全贴壁，移除铺板培养基（含部分死细胞），加入维持培养基，每2天换液1次。
• 制备感染培养液：维持培养基中预先加入4%PEG8000并混匀，HBV病毒（HepAD38 MOI=500~1000, 纯化病人血清 MOI=100~500，更高的MOI可能进一步提高感染效率）。
• 移除旧培养液，加入感染培养液，在37℃/5% CO₂培养箱中培养16h或过夜。
• 移除感染培养液，PBS清洗3次，加入维持培养基，在37℃/5%CO₂培养箱中继续培养。
• HBV感染后每2天收上清1次，用于病毒抗原及HBV DNA检测，收集3dpi、5dpi、7dpi、9dpi上清，9dpi可结束细胞培养，更长的培养时间取决于细胞状态 (dpi: 感染后培养天数)。