I 简介

肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)在肝脏的生理功能和病理机制的发生中扮演重要的角色, 成为近年来肝脏研究的热点。研究发现LSEC组成了肝脏实质细胞与血液之间的半渗透屏障, 并参与肝脏代谢、免疫应答、肝脏内生长因子和细胞因子的分泌和调节过程, 在肝脏的生理功能和病理机制中扮演重要的角色。本产品采用酶灌注消化法分离至SPF级小鼠，保留了细胞在体内的生物活性；通过梯度离心除掉了其它肝脏细胞，具有超高纯度（>90%）。经检测无细菌、真菌、放线菌等污染，细胞活力高。公司可个性化定制原代细胞，可分离不同品系、不同药物处理的细胞，满足不同客户的需求。

II  试剂与材料

-小鼠肝窦内皮细胞（Cat# LV-MLSE001）            

-复苏培养基（Cat#LV-Rec001）

-肝窦内皮细胞培养基（Cat# LV-MLSEM001）        

-胶原包被培养板（LV-coated）

-碎冰及冰盒                                      

-无菌15ml离心管（冰上预冷）

-一次性移液管                                    

-恒温水浴锅（38℃预热）

-宽口移液枪头（普通移液枪头剪去尖头，再灭菌使用）

-移液枪

-冷冻水平离心机（带水平转子，可离心15ml离心管）        

-生物安全柜

-37℃/5%CO₂培养箱                           

-75%酒精

III 细胞的复苏与铺板

将15ml离心管插入盛有足量碎冰的冰盒中，紫外消毒15min；预冷离心机。

复苏培养基放碎冰中充分预冷，铺板培养基放入38℃恒温水浴锅中充分预热。

将冻存的细胞从冷藏位置迅速转移至38℃恒温水浴锅中，尽可能多的浸入38℃水中，顺时针水平摇动，但必须确保冻存

管管盖保持在水面以上。

解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有少量碎冰漂浮即可。

用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。

用宽口枪头将细胞重悬（轻轻吹打2次），并转移至预冷的15ml离心管中（注意：冻存管与枪头上有残留细胞存在，可用1ml复苏培养基对冻存管与枪头进行清洗）。

向细胞悬液逐滴加入预冷复苏培养基，每1ml细胞悬液加入10ml复苏培养基（注意：前3ml要缓慢逐滴加入并轻微摇晃，后面7ml可加快速度），最后轻微上下颠倒1次混匀。

300×g，4℃离心5min,去上清并用细胞培养基重悬。

沉淀的细胞用肝窦内皮细胞培养基重悬并定容至4ml，用台盼蓝排除法测定细胞的活力和细胞总量。

将细胞按3×10⁴cells/cm²密度接种至胶原包被培养板中。摇匀，在37℃/5%CO₂培养箱中培养，24h后换液。

IV 细胞培养与传代

• 细胞融合度达到80%时可进行传代。
• 提前将培养基、PBS、胰酶放入37℃水浴锅内预热，用75%酒精擦拭后再放入超净台内。
• 吸除旧培养液，加少量PBS润洗细胞，适量胰酶，使加入的胰酶能盖住细胞，37℃孵育，约2~3min显微镜下观察。
• 待贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时弃去胰酶，加入新鲜肝窦内皮细胞培养基，晃动细胞瓶，终止胰酶作用，用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液（控制吹打的力度，避免产生大量的气泡）。
• 300×g，室温离心5min，去上清并用培养基重悬。
• 将细胞悬液按3×10⁴cells/cm²密度接种到新的胶原包被培养瓶/板内， 置37℃/5%CO₂培养箱培养，隔天观察贴壁生长情况。