I 简介

立沃生物科技是一家专注于原代细胞分离、冻存与再生的技术型企业。我们的原代胰岛细胞分离自正规动物生产与繁育单位，所有材料来源清晰。我们的细胞产品经过多种测试，新鲜培养的（或者复苏后）细胞活力高、胰岛团结构完整、边缘相对光滑，可广泛应用于基础生命科学研究以及药物研发中。

II  试剂与材料

-大鼠胰岛细胞（Cat# LV-rPICs002）         

-胰岛细胞复苏培养基（Cat#LV-Rec001）

-胰岛细胞维持培养基（Cat#LV- rPICM001）   

-D-hank’s溶液

-0.25% trypsin-EDTA

-生物安全柜                           

-无菌15mL离心管           

-移液枪                   

-恒温水浴锅  

-37℃/ 5% CO₂培养箱   

-非TC-treated 10cm细胞培养皿

-宽口枪头（普通枪头剪去尖头，再灭菌使用）  

-细胞培养瓶（板）

-FDA/PI（荧光素双醋酸酯/碘化丙啶）

-GSIS试剂盒

III 细胞的复苏与铺板

• 将胰岛细胞复苏培养基和维持培养基于38℃恒温水浴锅中预热20min。
• 生物安全柜中，在非TC-treated 10cm细胞培养皿中加入10mL胰岛细胞复苏培养基，备用；
• 将冻存的大鼠胰岛细胞从冷藏位置迅速转移至38℃恒温水浴锅中，尽可能多的浸入38℃水中并顺时针旋转解冻90 ~ 120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。必须确保冻存管盖子保持在水面以上。
• 用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。
• 用宽口枪头吸出细胞，并轻柔地滴加到含预热的10mL胰岛细胞维持培养基的非TC-treated 10cm细胞培养皿中（注意：冻存管与枪头上残留少量细胞，可用复苏培养基对冻存管与

枪头进行冲洗后合并到非TC-treated 10cm细胞培养皿中）。

• 将细胞培养皿前后左后轻柔晃动2-3次后室温放置30min。
• 取适量细胞用FDA/PI染色观察胰岛细胞的死活情况。
• 步骤7得到的细胞，根据具体实验用途选择合适的处理方式（以下处理仅供参考）。

a. 胰岛细胞：在体式显微镜下，用20μL吸头挑取完整性较好的胰岛细胞作处理。

a.1 葡萄糖刺激下的胰岛素分泌实验（GSIS）：具体操作参见GSIS试剂盒说明书。

a.2 胰岛细胞培养：可根据实验要求，选择不同规格的细胞培养瓶或细胞培养板。若需要贴壁培养，则选择TC-treated细胞培养瓶（板）；若需要悬浮培养，则选择非TC-treated细胞培养瓶（板）；胰岛细胞培养密度建议为10~20个/mL胰岛细胞维持培养基，3~4天半量换液，7天一次全量换液。可根据具体实验要求，在胰岛细胞维持培养基中添加不同成分。

a.3 胰岛细胞移植：根据不同受体和移植位点的需求或者具体实验要求，挑取指胰岛当量（IEQ）的胰岛细胞，移植到指定受体的具体移植位点中，每天监测受体的血糖变化和身体状况并作记录。

b. 胰岛单细胞：

b.1 将第7步中的胰岛细胞收集到15mL离心管中，500×g常温离心5min，完全弃掉上清，然后用5mL预热的D-hank’s液重悬，500×g常温离心5min，完全弃上清。

b.2 加入10~20倍细胞沉淀体积的0.25% trypsin-EDTA消化液重悬，37℃孵育5min，然后于生物安全柜中用200μL枪头轻柔吹散30s；继续37℃孵育3min和吹打30s，直至肉眼不可见团状胰岛细胞（注意：消化总时长勿超过20min，以免细胞活性过低）。

b.3 加入5倍消化液体积的维持培养基终止消化，500×g常温离心5min，完全弃上清，适量维持培养基重悬。

b.4 用台盼蓝排除法测定胰岛单细胞的存活率和细胞总量。

b.5 根据具体实验要求，对胰岛单细胞进行相应的处理。胰岛单细胞按5~10×10⁴/mL胰岛细胞维持培养基的密度进行培养，采取贴壁培养。